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Revista chilena de infectología - Biología molecular en Infectología: Parte I: Desarrollo y metodologías

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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. v.19 n.1 Santiago  2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182002000100003 

Biología molecular en Infectología
Parte I: Desarrollo y metodologías

MOLECULAR BIOLOGY IN INFECTIOUS DISEASES.
PART I. DEVELOPMENT AND METHODOLOGIES

ALEJANDRO CORVALÁN R.*

* Laboratorio de Biología Molecular Clínica Las Condes, Unidad de Desarrollo Instituto de Salud Publica de Chile e Instituto Chileno Japonés de Enfermedades Digestivas Hospital Clínico San Borja-Arriarán.

Financiamiento: Proyecto Métodos de Vigilancia Epidemiológica, Subdirección Académica Clínica Las Condes 2000.

Eventhough Molecular Biology was iniciated at the end of the XIX century, the discovery of the structure of DNA is considered the beginning of this field. Advances during 1960-1970 produced methods and technologies to study microorganisms at molecular level. In particular, the discovery of DNA polymerase and the specificity of DNA reanaturation are the bases for Polymerase Chain Reaction, Transcription Mediated Amplification, and Branched DNA methods useful for diagnosis and direct quantitation of infectious agents. Finally, the complete genome sequence should ultimately result in new methods for diagnosing and treating infectious diseases.

Key words: Infectious diseases, Molecular biology, Molecular methods.

INTRODUCCIÓN

La biología molecular es una disciplina de la bioquímica que estudia, entre otras, las moléculas de ácidos nucleicos, el ácido desoxirribonu-cleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN). Los orígenes de la biología molecular se pueden rastrear hasta el siglo pasado pero históricamente se considera la descripción de la estructura de doble hebra del ADN como el origen de esta disciplina.1 Los avances más relevantes de la biología molecular se muestran en la Tabla 1. Se observa que a partir de la descripción de Watson y Crick se produjo una creciente acumulación de descubrimientos, especialmente en la década de 1960, que nos permiten hoy tener las herramientas necesarias para estudiar agentes infecciosos a nivel molecular.2

Hitos en el desarrollo de la biología molecular

El aislamiento de la molécula de ADN se realizó por primera vez en 1869, a partir de núcleos aislados de linfocitos humanos y se denominó "nucleina".3 Diez años más tarde Koseel demostró que la nucleina estaba compuesta por 4 bases orgánicas, adenina, guanina, timina y citosina y, en 1924, Fuegel desarrolló un marcador químico para demostrar por microscopia de luz que el ADN estaba en el núcleo de todas las células de distintas especies.3 En 1944 Avery, MacLeod y McCarty demostraron que en el ADN estaba la información responsable de la herencia.4 Sin embargo, este descubrimiento no tuvo mayor impacto en su época ya que en ese momento se creía que el contenido de las cuatro bases era similar en todas las moléculas de ADN y por lo tanto no explicaba la diversidad genética.3 En 1950 Chargaff demostró que la composición química del ADN variaba enormemente entre un organismo y otro, y que a pesar de ello, siempre existía una concentración molar equivalente entre adenina - timina y citosina - guanina.5 En 1953, basándose en este descubrimiento y utilizando datos de difracción de rayos X, Watson y Crick propusieron el modelo de doble hebra para la estructura del ADN.1,6 En este modelo las bases nitrogenadas de cada hebra forman una cadena unidas por grupos fosfatos externos e internamente las bases interactúan con bases complementarias (adenina - timina y citosina -guanina) de la otra hebra a través de enlaces de hidrógeno. El descubrimiento de Watson y Crick permitió conocer la estructura del ADN y comprender el mecanismo de la herencia, en el que cada hebra sirve de molde para su propia replicación (replicación semiconservativa) y es considerado como el inicio de la biología molecular.6 En 1960, Kronberg aisló y purificó la enzima responsable de la replicación del ADN, la ADN polimerasa.7 El descubrimiento de esta enzima permitió definir elementos críticos para la síntesis de la molécula de ADN, en particular el sitio de inicio de la síntesis formado por ADN de doble hebra. Este descubrimiento es la base para todos los métodos de síntesis de ADN in vitro como la reacción de polimerasa en cadena. Ese mismo año, Doty et al8 descubrieron las propiedades de hibridación del ADN. Contrariamente a lo pensado en esa época, que la separación por calor del ADN doble hebra (denaturación) era un fenómeno irreversible, estos investigadores observaron que si el ADN denaturado era llevado a 65o C, se volvía a formar ADN doble hebra. Estos autores denominaron este fenómeno renaturación o hibridación del ADN8 y incluso demostraron que podía ocurrir entre moléculas de ADN y ARN con una sensibilidad de 1:100.000. El descubrimiento de Doty et al sentó las bases para todos los métodos de hibridación utilizados actualmente con la única diferencia de que en los métodos actuales se introduce un fragmento de hebra simple, denominado "sonda", el que al estar en una concentración mayor al ADN doble hebra y producirse la renaturación, forma un híbrido "sonda:ADN".7 En 1962, Arber aisló y purificó enzimas que cortaban el ADN en secuencias específicas.9 Estas enzimas tenían la particularidad de reconocer secuencias palindrómicas en el genoma y cortar ambas hebras. La función de estas enzimas es proteger a las bacterias de infecciones virales degradando el ADN viral.10 La utilización de estas enzimas en análisis de ADN permitió cortar esta gran molécula en fragmentos mas pequeños y específicos y así estudiarla en regiones discretas. Posteriormente, el descubrimiento de enzimas con capacidad de unir fragmentos de ADN, la ADN ligasa11 dio origen a moléculas de ADN recombinante. Al combinar el corte con enzimas de restricción en dos moléculas diferentes y reunir los fragmentos generados utilizando la ADN ligasa, se crearon las primeras moléculas de ADN recombinante dando origen a la ingeniería genética.11

Tabla 1. Principales avances de la biología molecular

Figura 1. Método de secuenciación de Maxam y Gilbert. La secuencia (CTGCATGGGCGGC-ATGAACCG) será la utilizada como templado, el partidor (CTCGAT) definirá la región a amplificar, los reactivos dNTP son los cuatro deoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) utilizados en la reacción de secuenciación, los reactivos ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP son los cuatro dideoxinucleótidos que se incorporan en forma única en cada tubo de reacción y que bloquean la extension de la reacción de secuenciación al no permitir la incorporación de nuevos dNTP.

En 1975, Southern12 desarrolló un método para fijar ADN digerido por enzimas de restricción a un soporte sólido y realizar en él, la hibridación con sondas específicas. Esta técnica se basa en la separación del ADN por migración electroforética a través de un polímero, usualmente agarosa, y posteriormente transferirlo y fijarlo a una membrana de nitrocelulosa. La técnica desarrollada se llamó Southern-blot y la extensión de esta metodología a ARN se denominó Northern-blot y a proteínas, Western-blot.7 Otras variaciones de este método, que no utilizan la separación electroforética, se denominan dot-blot o slot-blot.7 Entre 1975 y 1977 dos grupos, Sanger et al13 y Maxam y Gilbert,7 desarrollaron métodos de secuenciación del ADN. Ambos métodos difieren en que uno permite leer el código genético rompiendo la molécula de ADN en nucleótidos específicos y el otro, incorporando nucleótidos que bloquean la extensión de la síntesis de ADN7 (Figura 1) Este último método es el más utilizado actualmente, en particular, en los métodos de secuenciación automática.

Figura 2. Reacción de polimerasa en cadena. Cada hebra de ADN (templado) sirve como molde para la amplificación y sólo la región comprendida entre ambos partidores será amplificada en forma exponencial. Cada ciclo se divide en tres etapas: denaturación, alineamiento y extensión, al final de las cuales se generan nuevos templados los que son utilizados en el ciclo siguiente.

En 1985, Mullis reunió algunas de las metodo-logías mencionadas para realizar síntesis de ADN in vitro en forma exponencial, denominando este método reacción de polimerasa en cadena (en inglés Polymerase Chain Reaction: PCR*).14 Esta metodología es considerada como una revolución dentro la biología molecular ya que con la amplificación exponencial es posible el análisis de moléculas de ADN o ARN, a partir de mínimas cantidades de muestras.

Métodos de biología molecular

Reacción de polimerasa en cadena

El método de PCR se basa en ciclos de amplificación exponencial de un fragmento especifico de ADN. Este fragmento está determinado por secuencias introducidas en la reacción, denominadas "partidores", y a partir de los cuales la enzima ADN polimerasa, realiza la síntesis exponencial (Figura 2). Cada ciclo de amplificación consta de tres etapas: denaturación, alineamiento y extensión. La denaturación se realiza a 95o C y la separación conseguida permitirá que cada hebra sirva como molde o templado para la síntesis de una nueva molécula de ADN. El tiempo de denaturación depende del largo del templado, y generalmente dura entre 30 segundos y 1 minuto. Debido a que al comienzo de la amplificación es necesario separar todo el ADN de la muestra analizada, inicialmente se realiza una incubación de 5 minutos a 95o C por una sola vez. Después de la denaturación sigue la etapa de alineamiento entre el ADN templado y los partidores. Esta etapa se basa en el principio de la renaturación de Doty et al8 ya que ocurre al llevar la reacción a 45o C - 60o C. Sin embargo, dado que los partidores están en mayor concentración que el templado, se favorecerá el alineamiento entre templado: partidor por sobre templado: templado. El ADN doble hebra formado (templado: partidor) definirá el sitio de acción de la ADN polimerasa o extensión, etapa en la cual esta enzima unirá nucleótidos libres en forma complementaria a la secuencia del templado. La extensión ocurre a 72o C que es la temperatura de máxima eficiencia de la enzima y el tiempo de la extensión dependerá de la distancia de los partidores entre sí. En general se ha calculado que la ADN polimerasa es capaz de incorporar 60 nucleótidos por segundo a 70o C,15 por lo que un minuto es tiempo suficiente para incorporar alrededor de 1.000 pares de bases. Ya que se ocupan dos partidores en la reacción, uno para cada hebra, y que estos quedan a una distancia de entrecruzamiento durante la síntesis de ADN, el segmento definido será amplificado en forma exponencial (Figura 2). Esto significa que en cada ciclo de amplificación se producirá una número de copias equivalente al exponente del número de hebras de ADN templado. Así por ejemplo, si al momento de iniciarse la amplificación sólo hay una molécula de ADN doble hebra (2 templados), después de 30 ciclos de amplificación se habrán generado 230 copias de ADN. Este número corresponde a 1,097,736,000 copias del segmento flanqueado por los partidores. El elemento mas crítico de la amplificación por PCR es el alineamiento. Dado que este fenómeno se basa en la complementariedad entre las bases nitrogenadas del templado y del partidor, ésta es una unión alterada por varios factores, entre otros la temperatura (Figura 3). La figura muestra el impacto de la variación de 5o C con relación a la cantidad de templado en la especificidad de la reacción. La importancia de la amplificación por PCR en Infectología se basa en que con esta magnitud de amplificación es posible el análisis de moléculas de ADN o ARN, a partir de mínimas cantidades de muestras. Así por ejemplo, si consideramos que una bacteria contiene 1 fg (10-9 g) de ADN, la amplificación por PCR permitirá generar alrededor de 0,1 µg (10-6 g) de una región especifica de ADN bacteriano. En la práctica, este método permite identificar secuencias presentes entre 10 y 50 copias en una muestra clínica y sin condiciones especiales de mantención. Aunque la PCR permite la amplificación de ácidos nucleicos, la visualización del producto amplificado requiere de otras metodologías posteriores a la amplifi-cación. El método más utilizado es la electroforesis de agarosa, técnica descrita por Southern12 en el que el producto, sometido a corriente eléctrica, migrará de acuerdo a su tamaño. Sin embargo, este es un método indirecto, porque sólo indica el tamaño del amplificado. La visualización directa requiere de métodos que "lean" la secuencia del amplificado. Entre estos métodos están cortes con enzimas de restricción, hibridación con sondas específicas (Southern-blot) o secuenciación del producto de PCR. El corte con enzima de restricción consiste en incubar el producto con enzimas de restricción que reconozcan secuencias palindrómicas dentro del producto amplificado y luego visualizarlo por electroforesis. Después de la digestión se observarán dos fragmentos, los que sumados equivaldrán al fragmento del producto sin digestión. La hibridación con sondas es el más utilizado en los kits comerciales y aunque tradicionalmente consiste en la técnica de Southern-blot, en los métodos comerciales se utiliza el formato ELISA, en el que la sonda esta fijada en los pocillos de la microplaca (Figura 4). La secuenciación (ver más adelante) sólo se ocupa como método de referencia. Uno de los mayores problemas de la amplificación por PCR es la inhibición, esto porque existen numerosos factores que anulan la actividad de la ADN polimerasa.16 En general la proporción de inhibición reportado es de alrededor del 5%, sin embargo, esta varía desde 3% para muestras de sangre periférica hasta 18,5% para muestras de anatomía patológica (tejido fijado en formalina e incluido en parafina) (Tabla 2). Una variación y automatización de la PCR es la amplificación en tiempo real o Light-Cycler System. Esta tecnología desarrollada en 199617, 18 se basa en la emisión de fluorescencia durante la extensión de la ADN polimerasa,19 lo cual permite el monitoreo continuo en cada ciclo de amplificación (Figura 5). Dado que la cantidad de fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de amplificación, este método es ideal para la cuantificación de ADN y ARN. Además una vez generado el producto, es posible monitorear su secuencia dado que la cinética de denaturación / renaturación del producto es secuencia dependiente y por lo tanto no son necesarios métodos adicionales para su visualización.19 En este método también es posible introducir sondas específicas para confirmar el producto amplificado lo cual aumenta su especificidad. Dado que este sistema utiliza tubos capilares, cada etapa de amplificación es significa-tivamente más corta que en la amplificación convencional, reduciendo el tiempo total de amplificación a sólo 30 minutos.20

Figura 3. Efecto de la temperatura de alineamiento en la especificidad de la reacción de polimerasa en cadena. La amplificación se realizó para citomegalovirus (100 copias) en tres condiciones de alineamiento (63, 65 y 68° C). Se observa que a mayor temperatura desaparecen las amplificaciones inespecíficas, quedando sólo la banda específica de citomegalovirus.

Figura 4. Hibridación en microplaca tipo ELISA. Este método de confirmación de la reacción de polimerasa en cadena se basa en etapa 1: unión de la sonda marcada con biotina (B) al pocillo de ELISA a traves de streptoavidina (S), etapa 2: hibridación, del producto amplificado marcado con digoxigenina (D) a la sonda, etapa 3: inmunodetección del producto amplificado por anticuerpos antidigoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina (E) y etapa 4: revelado, en el que se agrega un sustrato el cual precipita generando un color que es visualizado por lectura espectrofotométrica. (Cortesía BIOS-Chile I.G.S.A.)

Amplificación isotérmica

La amplificación isotérmica consiste en convertir, en forma cíclica, una molécula de ARN a ADN doble hebra y a partir de ella, realizar la transcripción a ARN, el cual sirve de templado para un nuevo ciclo de amplificación21,22 (Figura 6). En la amplificación isotérmica se requieren dos partidores, que definen el ARN mensajero a amplificar, y uno además contiene una secuencia denominada "promotora" para la enzima que realiza la transcripción (ARN polimerasa). Además de la ARN polimerasa participan otras dos enzimas, la transcriptasa reversa y la ARNasa H (Figura 6). Este método sólo amplifica ARN y su principal aplicación clínica está en el diagnóstico de agentes infecciosos23,24 y la cuantificación de la carga viral de virus ARN (VHB, VHC y VHI).25,26 La cuantificación de ARN se realiza co-amplificando el ARN de la muestra en forma conjunta con calibradores internos o ARN de concentración conocida y se mide mediante electroquimio-luminiscencia.27

Tabla 2. Inhibiciones en amplificación por reacción de polimerasa en cadena

Figura 5. Método de amplificación en tiempo real. Este sistema se caracteriza por la presencia de una sonda doblemente marcada en 5` con un fluoróforo de reporte y en 3` con un fluoróforo de ocultamiento (etapa 1). Durante la extensión, la ADN polimerasa hidroliza esta sonda liberando el fluoróforo de reporte (etapa 2). La cantidad de fluoróforo liberado es proporcional a la cantidad de producto de PCR amplificado.

Figura 6. Método de amplificación isotérmica. En este método, el proceso comienza con la hibridación entre el ARN en estudio y el partidor 1, que contiene el sitio promotor para la ARN polimerasa (etapa 1). A partir de esta hibridación, la transcriptasa reversa genera una hebra simple de ADN, denominado ADN copia (cADN), creando un híbrido ARN: cADN (etapa 2). El ARN de este híbrido es degradado por la ARNasa H, quedando el cADN hebra simple, el cual se une al partidor 2 (etapa 3). A partir de este partidor y por acción de la transcriptasa reversa se produce la hebra complementaria generando ADN doble hebra. A partir del sitio promotor contenido en el partidor 1, se realiza la transcripción a ARN por la ARN polimerasa (etapa 4) generando múltiples templados de ARN, los cuales son utilizados como templados para repetir el proceso.

Hibridación de ADN ramificado

(Branched DNA)

La metodología de hibridación con ADN ramificado o branched DNA (bDNA) se basa en hibridaciones consecutivas de sondas que reconocen por una parte la secuencia de ADN o ARN en estudio y por otra, secuencias introducidas a la reacción para amplificar la señal de hibridación (Figura 7).28 En este método la visualización del ADN blanco no depende de un proceso enzimático, como en la reacción de polimerasa en cadena, sino de la amplificación de la señal de hibridación. Esta metodología es altamente reproducible y se utiliza clínicamente en la cuantificación de carga génica en pacientes portadores del VIH, VHB y VHC.30, 31

cDNA microarray

La tecnología de cDNA microarray se basa en la incorporación en un chip, similar al utilizado en computación, de 5.000 a 8.000 sondas que representan la totalidad de los genes expresados por un microorganismo.32,33 De este modo se puede identificar los patrones de expresión bacteriana de acuerdo a distintas condiciones fisiológicas o patológicas. El principio de cDNA microarray es la hibridación, pero a diferencia de los métodos tradicionales, se utilizan múltiples sondas, las que unidas a un sistema cuantitativo de análisis, permiten identificar patrones de expresión génica.33 Esta metodología, aunque aún se encuentra a nivel experimental, tiene una proyección tan importante en clínica como la PCR.

Figura 7. Método de ADN ramificado (branched DNA) para cuantificación de ácidos nucleicos. El proceso comienza con la hibridación de las sondas de captura a una fase sólida. A continuación se produce la reacción de hibridación entre las sondas de captura y el ADN o ARN en estudio, lo cual es seguido de la introducción de la sonda de amplificación que contiene múltiples sitios para las sondas de revelado. Estas últimas están conjugadas con moléculas quimioluminiscentes de modo que la cantidad de luz emitida es proporcional a la cantidad de ADN o ARN hibridado.

Figura 8. Potenciales aplicaciones clínicas de la secuenciación de genomas de microorganismos

Secuenciación

Los métodos de secuenciación permiten "leer" el código genético de un microorganismo. Las principales aplicaciones de la secuenciación en Infectología están en la identificación de nuevos patógenos, la caracterización de brotes epidémicos y la identificación de patrones genéticos que determinan la resistencia a terapia.34 Específicamente, la resistencia de la transcrip-tasa reversa y proteasa a fármacos antivirales en pacientes VIH,35 resistencia a ganciclovir en citomegalovirus36 y resistencia a rifampicina en Mycobacterium tuberculosis,37 son algunas las aplicaciones clínicas más importantes de la secuenciación. Finalmente la secuenciación ha permitido conocer el genoma completo de microorganismos tales como Neisseria menin-gitidis,38 M. tuberculosis,39 Clostridium perfrin-gens,40 Streptococcus pyogenes41 y Helicobacter pylori.42 La posibilidad de analizar el genoma completo de micro-organismos está permitiendo estudiar las interacciones microorganismo-huésped y con la ayuda de herramientas computacionales (bioinformática) desarrollar nuevos agentes terapéuticos y vacunas.43

RESUMEN

El origen de la biología molecular se puede rastrear hasta fines del siglo XIX; sin embargo, el descubrimiento de la estructura del ADN se considera como el inicio de esta disciplina. Los avances producidos por la biología molecular en la década del ´60 nos permiten contar hoy con herramientas para el estudio de microorga-nismos a nivel molecular. En particular, el descubrimiento de la ADN polimerasa y las propiedades de hibridación del ADN son algunos de los descubrimientos que aplicados hoy día en la reacción de polimerasa en cadena, la amplificación isotérmica y la hibridación con ADN ramificado, se han transformado en herramientas útiles en el diagnóstico y cuantificación de agentes infecciosos. Finalmente la secuenciación de genomas bacterianos completos permitirá el desarrollo de nuevos métodos para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades infecciosas.

* Nota del Editor: PCR sigla utilizada en este artículo y universalizada en la literatura científica aunque en español se había acuñado con anterioridad con otra acepción indicada en el listado de abreviaturas de esta publicación.

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Agradecimientos. Se agradece a Teresa Lobos, Maritza Ríos y Jorge Fernández por la revisión crítica del manuscrito.

Correspondencia a:
Alejandro Corvalán Rodríguez
E-mail: acorvalan@mi-mail.cl