Original Experimental Research Journal of Chinese Integrative Medicine: Volume 6 January, 2008 Number 1DOI: 10.3736/jcim20080111 Antitumor activities of kushen flavonoids in vivo and in vitro 1. Ming-yu SUN (Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China E-mail: mysun248@hotmail.com ) 2. Jian ZUO (Department of Pharmacology, Hutchison Medipharma Ltd, Zhangjiang Hi-Technology Park, Shanghai 201203, China ) 3. Ji-feng DUAN (Department of Pharmacology, Hutchison Medipharma Ltd, Zhangjiang Hi-Technology Park, Shanghai 201203, China ) 4. Jun HAN (Department of Pharmacognosy, School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China ) 5. Shi-ming FAN (Department of Pharmacology, Hutchison Medipharma Ltd, Zhangjiang Hi-Technology Park, Shanghai 201203, China ) 6. Wei ZHANG (Department of Pharmacology, Hutchison Medipharma Ltd, Zhangjiang Hi-Technology Park, Shanghai 201203, China ) 7. Li-fang ZHU (Department of Pharmacology, Hutchison Medipharma Ltd, Zhangjiang Hi-Technology Park, Shanghai 201203, China ) 8. Ming-hui YAO (Department of Pharmacology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China )
Objective: To explore the antitumor activities of kushen (Sophora flavescens ) flavonoids (KS-Fs) in vivo and in vi tro.
Methods: Cell proliferation was assayed by using methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method. H22 hepatocellular carcinoma and S180 sarcoma were induced in ICR mice. Lewis lung carcinoma was induced in C57BL/6 mice. H460 and Eca-109 tumor were induced in Balb/c nude mice by injecting 5×105 or 5×106 tumor cells in the right flank, respectively.
Results: KS-Fs could inhibit the growth of a variety of human tumor cell lines (A549, SPC-A-1, NCI-H460, etc.) in vitro . The antitumor efficacies were confirmed in the mice models of H22, S180 and Lewis lung tumors and the nude mice models of human H460 and Eca-109 xenografted tumors. The oral or intravenous maximum tolerated dose of KS-Fs was more than 2.8 g/kg or 750 mg/kg respectively, far more than the oral medial lethal dose of kushen alkaloids (≤1.18 g/kg). No adverse reactions were observed.
Conclusion: These results suggest that KS-Fs or kurarinone may be developed as a novel antitumor agent.
Sun MY, Zuo J, Duan JF, Han J, Fan SM, Zhang W, Zhu LF, Yao MH. J Chin Integr Med/Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2008; 6(1): 51-59. Received March 5, 2007; published online January 15, 2008. Free full text (PDF) is available at www.jcimjournal.com . Indexed/abstracted in and full text link-out at PubMed. Forward linking and reference linking via CrossRef. DOI: 10.3736/jcim20080111
Correspondence: Ming-yu SUN, MD, Associate Professor; Tel: 021-51328888-8112; Email: mysun248@hotmail.com
苦参( Sophora flavescens Aiton )为豆科槐属植物,是中国传统常用中药之一,始载于《神农本草经》,列为中品,常用于治疗急、慢性炎症和癌症等疾病。苦参主要含有生物碱和黄酮两大类化学成分[ 1 ] 。1992 年以苦参碱和氧化苦参碱为主的苦参总碱注射液吗特灵[( 92 )卫药试字 X-10 ( 2 )号]已作为抗肿瘤药批准上市。相对于苦参碱,苦参黄酮的研究较迟。现已从苦参根中分离出 56 种黄酮类化合物,其中大部分化合物的 A 环上存在异戊烯基侧链[ 2-14 ] 。研究表明异戊烯基侧链黄酮有抗病原微生物、抗炎、抗肿瘤(体外)等生物活性[ 2-14 ] 。
一系列从苦参中分离出的含异戊烯基侧链的苦参黄酮在体外对一些人肿瘤细胞株有细胞毒活性,例如人白血病HL-60 [ 2 ] 、K562 ,小鼠白血病 L1210 [ 10 ] ,人乳腺癌MCF-7 [ 11 ] ,非小细胞肺腺癌A549 ,卵巢癌 SKOV-3 [ 12 ] 、1A9 [ 9 ] ,皮肤黑素瘤SK-MEL-2 ,中枢神经系统肿瘤 XF498 ,肠癌 HCT [ 12 ] ,子宫颈癌HeLa [ 10 ] ,鼻咽上皮癌KB , KB-Vin ( drug-resistant variant KB )等细胞株[ 10 ] 。这些黄酮还可以抑制一些酶的活性,例如phospholipase Cγ1 [ 7 ] ,diacylglycerol acyltransferase [ 9 , 13 ] ,tyrosinase [ 5 , 14 ] ,testosterone 5α-reductase [ 6 ] ,cGMP phosphodiesterase 5 [ 8 ] 。但苦参黄酮在体内是否有抑制肿瘤作用,目前国内外均没有相关报道。
本研究提取分离苦参总黄酮(kushen flavonoids, KS-Fs )和苦参酮( kurarinone, Kur ),检测 KS-Fs 和 Kur 对肿瘤细胞增殖的影响,并比较 KS-Fs 与市售苦参碱( kushen alkaloids, KS-As )制剂(主要成分为苦参生物碱或氧化苦参碱)的细胞毒作用。考察 KS-Fs 和 Kur 对小鼠 S180 肉瘤、 H22 肝癌和 Lewis 肺癌及裸小鼠人移植肿瘤非小细胞肺癌 H460 和食管癌 Eca-109 的影响。
1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 药物 苦参饮片,雷允上医药有限公司,经鉴定为豆科槐属植物苦参的根,苦参碱含量大于2% ,符合《中华人民共和国药典》 1995 年版规定。苦参素( kushenin ),宁夏制药厂;苦参碱注射液,广州明兴制药厂。体外实验:将 KS-Fs 和 Kur 用二甲亚砜( dimethyl sulfoxide, DMSO )配制成 20 mg/ml 储备液,- 20 ℃ 贮存,临用时用相应细胞培养液稀释到所需终浓度。体内药效实验:将 KS-Fs 和 Kur 用 5% DMSO 和 9% Cremophor EL 助溶后,加 85% 蒸馏水配成溶液。急性毒性实验注射配方:用 10% DMSO 和 18% Cremophor EL 溶解到最大浓度,加蒸馏水配成终浓度为 50 mg/ml 溶液。急性毒性实验口服配方: 20% 聚乙二醇( PEG 400 ), 18% Cremophor 溶解到最大浓度,加蒸馏水配制成混悬液,终浓度为 70 mg/ml 。注射用环磷酰胺( cytoxan, CTX ),江苏恒瑞医药股份有限公司,批号为 04061821 ;注射用顺铂( cisplatin ),齐鲁制药有限公司,批号为 04051241 ;临用时用生理盐水稀释。 1.1.2 细胞株 肺癌A549 、 SPC-A-1 、 NCI-H460 ( H460 )、 H446 ,人乳腺癌 MDA-MB-231 、 MCF-7 ,子宫颈癌 HeLa ,肠癌 HCT-116 、 HT-29 、 SW-620 和 CaCo-2 细胞株,均购自美国菌种细胞保藏数据库( American Type Culture Collection, ATCC );白血病 HL-60 、食管癌 Eca-109 、胃癌 BGC-823 和肝癌 SMMC-7721 细胞株以及小鼠 S180 肉瘤、 H22 肝癌和 Lewis 肺癌细胞,均购自中国科学院细胞生物研究所。 1.1.3 动物 Balb/c-nu/nu 裸小鼠,雄性, 6 ~ 8 周龄, 18 ~ 22 g ,上海市肿瘤研究所,合格证号: 2002-0001 。雌性 ICR 、 C57BL/6 小鼠, 20 ~ 22 g ;昆明鼠,雌雄各半, 20 ~ 22 g 。均购自斯莱克动物中心,合格证号: 2003-0003 。 1.1.4 试剂 伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Iscove's modified Dulbecco's medium, IMDM )、达尔伯克改良伊格尔培养基( Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM )、 1640 培养基、胎牛血清和 0.05% 胰酶-乙二胺四乙酸,来自 GIBCO 公司;青霉素、链霉素、 DMSO 、甲基噻唑基四唑( methyl thiazolyl tetrazolium, MTT )和 Cremophor EL ,为 Sigma 公司产品。 1.2 方法 1.2.1 KS-Fs 和 Kur 的分离提取 由和记黄埔医药有限公司提取鉴定。将苦参饮片粉碎成粗粉,10 倍量 95% 乙醇渗漉,渗漉液经减压浓缩,加水以石油醚萃取,回收后得到 KS-Fs 粗提物。乙醇重溶解,过大孔树脂得到 KS-Fs ,紫外分光光度计检测( ultraviolet rays, UV )方法检测黄酮含量和纯度。 KS-Fs 经过聚酰胺和硅胶柱联用层析分离提取得到 Kur 。
5 kg 苦参用乙醇渗漉、溶剂萃取得到 KS-Fs 粗提物 126 g ,得率为 2.52% ,黄酮含量超过 55% 。乙醇重溶解,过大孔树脂得到 KS-Fs , UV 方法检测黄酮含量,纯度超过 80% 。 KS-Fs 经过聚酰胺和硅胶柱联用层析分离提取得到 Kur 。 KS-Fs 主要含有 Kur ,降苦参酮( norkurarinone, NKur )和二甲氧基苦参酮( 2'-methoxy-kurarinone, MKur )及其他黄酮,其中 Kur 、 NKur 和 MKur 的含量分别是 29.5% 、 4.6% 和 1.4% 。见图 1 。
图 1 KS-Fs 的高效液相图谱和主要化合物结构
Figure 1 High-performance liquid chromatograms and chemical structures of compounds in KS-Fs 1.2.2 KS-Fs 和 Kur 在体外对肿瘤细胞株的抑制作用 将(0.5 ~ 1 ) ×105 个生长至对数生长期的细胞接种于 96 孔板,细胞在 37 ℃ , 5% CO2 培养箱中培养 24 h 后,更换成含不同浓度药物的培养基,其中 KS-Fs 、 Kur 和其他待测药物按梯度浓度加入,共设 8 个浓度,每孔中药物溶剂( DMSO 或水)的体积不超过 1% 总体积。每个浓度设 3 个复孔,继续培养 48 h , MTT 法检测[ 15 ] 。以溶剂孔为对照,数据用XLfit Wizard 软件分析,计算各药物对细胞生长抑制的半数抑制浓度( median inhibitory concentration, IC50 )。实验重复 3 次。 1.2.3 KS-Fs 和 Kur 体内抗肿瘤作用 1.2.3.1 小鼠肿瘤模型的建立 小鼠S180 肉瘤、 H22 肝癌和 Lewis 肺癌细胞,采用中国科学院上海细胞研究所推荐的培养基和血清浓度培养在 25 ~ 75 ml 培养瓶中,置于 37 ℃ , 5% CO2 培养箱中静止培养。
分别收集对数生长期 S180 和 H22 细胞,调整细胞数为 5×106 /ml 。 ICR 小鼠腹腔注射细胞悬液,每只 0.2 ml 。体内腹水传两代后,无菌条件下抽取生长良好的 S180 肉瘤或肝癌 H22 小鼠腹水,用生理盐水稀释至 5×106 /ml ,充分混匀种植于小鼠右前腋下,每只 0.2 ml 。
收集对数生长期 Lewis 肺癌细胞,以 5×106 /ml 种植于 C57BL/6 小鼠右前腋下,每只 0.2 ml 。动物种植肿瘤细胞后,每天观察小鼠情况,待肿瘤长出后,每隔 2 ~ 3 d 测量肿瘤直径,并估计肿瘤质量。体内传两代后,待 Lewis 肺癌瘤块长到直径大约 1 cm 左右时,选取肿瘤生长旺盛,无溃破的肿瘤,在无菌条件下剥离肿瘤,去除坏死部分,剪成约 1.5 ~ 2.0 mm3 大小组织块,皮下接种于 6 ~ 8 周龄健康的雌性 C57BL/6 小鼠右侧腋下。 1.2.3.2 裸鼠肿瘤模型的建立 收集对数生长期的H460 和 Eca-109 细胞,调整细胞数为 5×105 /ml 或 5×106 /ml ,无菌注射于 Balb/c-nu/nu 裸鼠右侧背部近腋窝处,每只 0.2 ml 。裸鼠在标准无菌环境下饲养,每天观察并测量肿瘤直径,待肿瘤直径大约为 1 cm 左右时,保种传代。肿瘤体积计算公式: V= ( W2×L ) /2 , W 代表肿瘤的宽度, L 代表肿瘤的长度[ 16 ] 。在无菌条件下自保种传代的H460 或 Eca-109 裸鼠中剥离肿瘤,剪成约 1.5 ~ 2.0 mm3 大小组织块,分别皮下接种于 Balb/c-nu/nu 裸鼠右侧腋下,肿瘤块体积大致相等。 1.2.3.3 分组、给药、测量和取材 小鼠接种H22 肝癌第 2 天,将小鼠随机分组,设 KS-Fs 溶剂对照组, KS-Fs 高( 500 mg/kg )、中( 100 mg/kg )、低( 20 mg/kg )剂量组, CTX ( 30 mg/kg )阳性对照组。小鼠接种 S180 肉瘤第 2 天, Lewis 肺癌小鼠肿瘤长至 150 mm3 左右时(接种后第 8 天),将小鼠随机分组,设 KS-Fs 溶剂对照组, KS-Fs 高( 200 mg/kg )、低( 60 mg/kg )剂量组, CTX ( 30 mg/kg )阳性对照组。各组小鼠均腹腔注射给药, 1 次 /d ,连续 7 d ,给药体积为 10 ml/kg 体质量。每天观察小鼠的一般情况,体质量变化,每周测量 2 次小鼠体质量。小鼠接种 S180 肉瘤、 H22 肝癌肿瘤后 10 d 及接种 Lewis 肺癌后 18 d 结束实验。脱颈椎处死小鼠,剥离肿瘤,称瘤质量,计算瘤质量抑瘤率,肿瘤质量抑制率( % ) = (对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量) / 对照组平均瘤质量 ×100 [ 17 ] 。
裸小鼠肿瘤长到 100 mm3 时,将裸鼠随机分组并开始给药。设溶媒对照组,只给予相应溶剂;阳性药对照组,静脉注射顺铂( 2 mg/kg , 1 次 /d ,连续给药 7 d ); KS-Fs 组,静脉注射 KS-Fs 200 mg/kg , 1 次 /d ,连续给药 21 d 。人移植肿瘤 Eca-109 裸小鼠加设 Kur 静脉注射高( 200 mg/kg )、低( 50 mg/kg )剂量组, 1 次 /d ,连续给药 21 d 。人非小细胞肺癌 H460 和食管癌 Eca-109 肿瘤移植裸小鼠分别于给药后第 25 天和第 22 天结束实验。脱颈椎处死裸小鼠,剥离肿瘤,称取瘤质量,计算瘤质量抑瘤率。
每天观察裸鼠的一般情况,体质量变化,计算相对体质量( relative body weight, RBW ),每只裸鼠的 RBW 是测量时的裸鼠体质量与实验初始状态时裸鼠体质量的比;每周测量 2 次移植瘤体积,计算相对瘤体积( relative tumor volume, RTV ),每个肿瘤的 RTV 是测量时的肿瘤体积与实验初始状态时肿瘤体积的比[ 18 ] )。描绘肿瘤生长曲线,并计算肿瘤的生长抑制率。生长抑制率(% ) = (溶媒组 RTV -治疗组 RTV ) / 溶媒组 RTV×100 。 1.2.4 急性毒性试验 昆明鼠随机分为4 组:口服溶媒对照组,口服 KS-Fs 组,静脉注射溶媒对照组,静脉注射 KS-Fs 组,每组各 10 只,雌雄各半。实验开始前,小鼠禁食 16 h ,口服组单次给予最大给药体积 0.04 ml/g , KS-Fs 给药剂量 2.80 g/kg ;静脉注射组单次给予最大给药体积 0.015 ml/g , KS-Fs 给药剂量 750 mg/kg ,连续观察 14 d 。 1.2.5 统计学方法 实验数据均以` x ±s ` x 表示,采用 SPSS 12.0 统计软件,组间比较采用方差分析和 q 检验。
2 结 果 2.1 KS-Fs 和 Kur 体外对肿瘤细胞株的抑制作用 首先考察了 KS-Fs 对多种人肿瘤细胞增殖的影响,结果表明 KS-Fs 可抑制 H460 、 A549 、 BGC-823 、 SMMC-7721 、 HT-29 和 SW-620 细胞的增殖, IC50 分别为 12.4 、 8.9 、 12.1 、 18.06 、 21.95 和 18.26 μg/ml 。 KS-Fs 与市售苦参碱抑制肿瘤细胞增殖作用的比较实验结果表明 KS-Fs 对 SPC-A-1 和 Eca-109 细胞的 IC50 分别为( 15.3±0.5 ) μg/ml 和( 12.4±0.4 ) μg/ml ,均远低于市售苦参素和苦参碱( IC50 >200 μg/ml )。见图 2 。
图 2 KS-Fs 与市售苦参碱制剂的体外细胞毒性
Figure 2 Cytotoxicity of marketed preparation of kushen alkaloids and KS-Fs in vitro
**P <0.01, vs KS-Fs-treated group.
在多个细胞株上验证了 KS-Fs 抑制肿瘤增殖作用。结果证明 KS-Fs 对小细胞肺癌细胞株 H446 ,非小细胞肺癌细胞株 H460 、 A549 、 SPC-A-1 ,结直肠癌细胞株 CaCo-2 、 HCT-116 、 HT-29 、 SW-620 ,乳腺癌细胞 MCF-7 、 MDA-MB-231 ,食管癌细胞 Eca-109 ,肝癌 SMMC-7721 等均有细胞毒作用, IC50 为 4.9~29.4 μg/ml ,其中对 H446 、 HeLa 和 A549 的 IC50 均小于 10 μg/ml ,对乳腺癌细胞 MDA-MB-231 的 IC50 则小于 5 μg/ml 。 Kur 细胞毒作用强于 KS-Fs , IC50 为 2.0 ~ 13.1 μg/ml 。 2.2 KS-Fs 和 Kur 体内抗肿瘤作用及毒性实验 2.2.1 KS-Fs 和 Kur 对 H22 肝癌、 S180 肉瘤和 Lewis 肺癌小鼠的影响 为考察 KS-Fs 是否在体内有直接抗肿瘤作用,首先利用 H22 肝癌模型小鼠评价 KS-Fs 的剂量效应关系。溶媒组小鼠在接种 H22 肝癌第 10 天肿瘤质量达到 2.47 g ,体积超过 800 mm3 , 20 、 100 和 500 mg/kg KS-Fs 腹腔注射,对小鼠肝癌 H22 肿瘤的生长呈明显的剂量依赖抑制作用( P <0.01),瘤质量抑瘤率分别为 43.40% 、 66.45% 和 78.98% 。见表 1 和图 3 。低、中、高剂量 KS-Fs 对小鼠的体质量均没有显著影响,小鼠一般状态良好。见表 1 。
表 1 KS-Fs 对 H22 肝癌小鼠肿瘤和体质量的影响
Table 1 Effects of KS-Fs on tumor and body weights in H22 hepatoma mice
(` x ±s` x )
Group
n
Body weight after tumor excision (g)
Tumor weight (g)
Inhibition rate (%)
Vehicle control
19
32.04±0.12
2.47±0.03
-
CTX-treated
10
32.23±0.23
0.47±0.02**
81.00
20 mg/kg KS-Fs-treated
10
32.88±0.22
1.40±0.08**
43.40
100 mg/kg KS-Fs-treated
10
32.69±0.18
0.83±0.05**
66.45
500 mg/kg KS-Fs-treated
10
33.77±0.10
0.52±0.02**
78.98
**P <0.01, vs vehicle control group.
图 3 KS-Fs 对 H22 肝癌和 S180 肉瘤小鼠肿瘤的影响
Figure 3 Effects of different doses of KS-Fs on the tumor of H22 hepatoma and S180 sarcoma in mice
A: H22 hepatoma; B: S180 sarcoma. 接下来,为进一步确证 KS-Fs 的体内抗肿瘤作用,我们设计了 S180 和 Lewis 肺癌小鼠肿瘤实验。溶媒组小鼠在接种 S180 肉瘤第 10 天肿瘤质量达到 2.91 g ,体积超过 1 000 mm3 , 60 、 200 mg/kg KS-Fs 腹腔注射,对小鼠 S180 肉瘤的生长有明显的抑制作用( P <0.01),瘤质量抑瘤率分别为 72.52% 、 82.14% 。见表 2 和图 3 。溶媒组小鼠在接种 Lewis 肺癌第 18 天肿瘤质量达到 2.57 g ,腹腔注射 60 和 200 mg/kg KS-Fs ,对小鼠 Lewis 肺癌的生长有明显抑制作用( P <0.01),瘤质量抑瘤率分别为 40.26% 和 59.74% 。与溶媒组相比, CTX 组动物体质量显著下降( P <0.05),而 KS-Fs 高、低剂量组小鼠的体质量均没有明显下降。见表 3 。
表 2 KS-Fs 对 S180 肉瘤小鼠肿瘤和体质量的影响
Table 2 Effects of KS-Fs on tumor and body weights in S180 sarcoma mice
(` x ±s` x )
Group
n
Body weight after tumor excision (g)
Tumor weight (g)
Inhibition rate (%)
Vehicle control
10
29.65±0.51
2.91±0.11
-
CTX-treated
10
27.51±0.14
0.43±0.02**
85.11
60 mg/kg KS-Fs-treated
10
31.73±0.42
0.80±0.08**
72.52
200 mg/kg KS-Fs-treated
10
34.41±0.29*
0.52±0.05**
82.14
*P <0.05, **P <0.01 vs vehicle control group.
表 3 KS-Fs 对 Lewis 肺癌小鼠肿瘤和体质量的影响
Table 3 Effects of KS-Fs on tumor and body weights in Lewis mice with lung carcinoma
(` x ±s` x )
Group
n
Body weight after tumor excision (g)
Tumor weight (g)
Inhibition rate (%)
Vehicle control
6
19.58±0.19
2.57±0.09
-
CTX-treated
6
18.38±0.07*
0.28±0.01**
88.96
60 mg/kg KS-Fs-treated
6
19.23±0.13
1.53±0.05**
40.26
200 mg/kg KS-Fs-treated
6
19.70±0.15
1.03±0.06**
59.74
*P <0.05, **P <0.01, vs vehicle control group.
为评价 KS-Fs 的安全性,我们进行了小鼠急性毒性试验,结果口服及静脉注射 KS-Fs 的半数致死量( lethal dose 50%, LD50 )都未测出。口服最大耐受剂量大于 2.8 g/kg ;静脉注射最大耐受剂量大于 750 mg/kg 。动物无任何异常表现。 2.2.2 KS-Fs 和(或) Kur 对人非小细胞肺癌 H460 和人 Eca-109 裸鼠移植模型的影响 为验证 Ks-Fs 在体内对人移植肿瘤裸小鼠的抗肿瘤作用,考察了 KS-Fs 和(或) Kur 对人非小细胞肺癌 H460 和人 Eca-109 裸鼠移植模型的影响。接种 H460 肿瘤的裸鼠,溶媒对照组的肿瘤 RTV 在治疗开始第 4 天达到 2.41 ,至第 25 天, RTV 达到了 36.04 ,肿瘤质量达到 3.19 g ;静脉注射 200 mg/kg KS-Fs ,第 4 天至第 25 天均能显著地抑制肿瘤生长( P <0.05, P <0.01),第 25 天肿瘤质量降至 1.70 g ,瘤质量抑瘤率( 46.8% )与顺铂组相当( 47.1% )。顺铂组裸小鼠体质量在治疗第 4 天开始显著下降( P <0.01),在整个治疗过程中,体质量与溶媒组的差异有统计学意义( P <0.01),最低体质量下降至治疗前体质量的 75% ( P <0.05, P <0.01)。 KS-Fs 组的相对体质量在 4 、 7 、 21 和 25 d 与溶媒组的差异有统计学意义( P <0.05);在 4 、 7 、 11 、 15 和 18 d ,明显高于顺铂组( P <0.05)。见表 4 和图 4 。
表 4 第 25 天时 KS-Fs 对人 H460 非小细胞肺癌裸小鼠移植肿瘤模型的影响
Table 4 Effects of KS-Fs on the tumor weight of H460 in xenografted nude mice on the 25th day (` x ±s` x )
Group
n
RTV
Tumor weight (g)
Inhibition rate (%)
Vehicle control
8
36.04±4.59
3.19±0.18
-
Cisplatin-treated
5
16.78±1.94**
1.69±0.06*
47.10
200 mg/kg KS-Fs-treated
8
19.24±1.03**
1.70±0.21*
46.80
*P <0.05, **P <0.01, vs vehicle control group.
图 4 KS-Fs 或 Kur 对人 H460 非小细胞肺癌和 Eca-109 食管癌裸小鼠移植肿瘤模型肿瘤体积和体质量的影响
Figure 4 Effects of KS-Fs or Kur on the relative tumor volume and relative body weight of H460 and Eca-109 xenografted tumors in nude mice
*P <0.05, **P <0.01, vs vehicle control group; △ P <0.05, △△ P <0.01, vs cisplatin-treated group.
接种 Eca-109 肿瘤的裸鼠,对照组的肿瘤 RTV 在治疗开始第 4 天达到 1.8 ,至第 22 天 RTV 达到了 9.1 ,而肿瘤质量达到 1.1 g ;静脉注射 200 mg/kg KS-Fs 或 Kur ,从第 4 天开始至第 22 天均能显著抑制肿瘤生长( P <0.05),肿瘤质量分别为 0.30 g 、 0.31 g ,瘤体积抑瘤率分别为 47.2% 、 42.7% ,与顺铂( 50.1% )组相当, KS-Fs 组和 Kur 组的相对体质量与模型组差异无统计学意义( P >0.05); KS-Fs 组在 4 、 8 、 11 、 15 和 18 d ,明显高于顺铂组( P <0.05)。见表 5 和图 4 。
表 5 第 22 天时 KS-Fs 和 Kur 对人 Eca-109 食管癌裸小鼠移植肿瘤模型的影响
Table 5 Effects of KS-Fs or Kur on the tumor weight of Eca-109 in xenografted nude mice on the 22nd day
(` x ±s` x )
Group
n
RTV
Tumor weight (g)
Inhibition rate (%)
Vehicle control
6
9.08±1.06
0.53±0.04
-
Cisplatin-treated
6
5.25±0.63**
0.27±0.02**
49.81
200 mg/kg Kur-treated
6
5.21±0.63*
0.31±0.02**
41.29
50 mg/kg Kur-treated
6
6.59±0.60
0.50±0.08
4.92
200 mg/kg KS-Fs-treated
6
4.80±0.79*
0.30±0.02*
42.71
*P <0.05, **P <0.01, vs vehicle control group.
综上所述,体内药效试验表明 KS-Fs 和(或) Kur 对小鼠 H22 肝癌、 S180 肉瘤和 Lewis 肺癌和人移植肿瘤食管癌 Eca-109 和非小细胞肺癌 H460 裸小鼠模型均有较好的抗肿瘤作用。 20 ~ 500 mg/kg KS-Fs 对小鼠 S180 、 H22 和 Lewis 肺癌的抑制率均大于 40% , 200 mg/kg KS-Fs 腹腔注射对 S180 肿瘤的抑制率超过 80% ,对 Lewis 肺癌达到 59.7% ; 500 mg/kg KS-Fs 对 H22 肿瘤瘤质量抑制率达到 79% ; 200 mg/kg KS-Fs 静脉注射对人移植肿瘤 H460 和 Eca-109 裸小鼠的肿瘤瘤质量抑制率也大于 40% ; 200 mg/kg Kur 静脉注射对 Eca-109 的抑制肿瘤作用与 KS-Fs 相当。
3 讨 论 文献报道苦参黄酮对多种细胞株有细胞毒作用,其中Kur 是 KS-Fs 中最主要的抑制肿瘤细胞增殖的黄酮之一。 Kur 对人白血病 HL-60 、肝癌 HepG2 、肺癌 A549 、卵巢癌 SKOV-3 、黑色素皮肤癌 SK-MEL-2 、中枢神经系统肿瘤 XF498 、结肠癌 HCT15 、结肠癌 HCT15/CL02 、神经胶质瘤 SF295 的 IC50 分别为 18.5 、 36.2 、 9.0 、 7.29 、 6.4 、 5.9 、 7.37 、 14.34 和 7.38 μg/ml [ 7 , 8 , 13 , 19 ] 。KS-Fs 中另外两个主要成分 NKur 和 MKur 也对肿瘤细胞表现出一定的细胞毒作用, NKur 对 SF295 、 SKOV-3 、 HCT15 、 HCT15/CL02 、 A549 和 SKMEL-2 的 IC50 分别为 4.25 、 5.63 、 5.46 、 12.14 、 15.4 和 12.9 μg/ml [ 13 , 19 ] ;MKur 对 HL-60 和 HepG2 的 IC50 分别是 13.7 和 21.1 μg/ml [ 7 , 13 ] 。我们的研究结果揭示,KS-Fs 和 Kur 对多个肿瘤细胞生长呈剂量依赖抑制作用, KS-Fs 的 IC50 为 4.9 ~ 29.4 μg/ml , Kur 作为 KS-Fs 的主要成分,细胞毒作用强于 KS-Fs , IC50 范围为 2.0 ~ 13.1 μg/ml 。
文献记载苦参碱或氧化苦参碱对白血病 K562 、乳腺癌 MCF-7 、卵巢癌 SKOV-3 和肝癌 HepG2 等肿瘤细胞株的 IC50 均在 200 μg/ml 以上,一般多为 500 ~ 1 000 μg/ml [ 20-22 ] 。我们的实验结果证明KS-Fs 对非小细胞肺癌 SPC-A-1 和食管癌 Eca-109 细胞的细胞毒作用远强于已经上市的苦参碱(氧化苦参碱)制剂 —— 苦参素(宁夏)和苦参碱(广州)。可见 KS-Fs 和 Kur 都比苦参碱(氧化苦参碱)有更好的细胞毒作用,有进一步开发研究的价值。
目前国内外均没有文献报道苦参黄酮的体内抑制肿瘤作用。我们首次证明 KS-Fs 能抑制小鼠 H22 肝癌和 S180 肉瘤,而且对小鼠 Lewis 肺癌及人食管癌 Eca-109 和非小细胞肺癌 H460 肿瘤移植裸小鼠模型均有较好的肿瘤抑制作用。 200 mg/kg KS-Fs 连续腹腔注射 7 d 对小鼠 H22 和 S180 肿瘤的瘤质量抑制率均大于 80% ,作用强于苦参碱和氧化苦参碱( 40% ~ 60% )[ 1 ] 。而Kur 作为 KS-Fs 的主要组成成分,对食管癌 Eca-109 裸鼠移植肿瘤的瘤质量抑制率与 KS-Fs 作用相近,大于 40% ;对胃癌 BGC-823 和喉癌 Hep-2 裸小鼠移植肿瘤的瘤质量抑制率分别为 39% 和 31% , Kur 基本能够代表 KS-Fs 抗肿瘤作用的主成分。苦参总碱小鼠口服的 LD50 为 1.18 g/kg [ 23 ] ,
苦参碱和氧化苦参碱腹腔注射,小鼠的 LD50 分别是 150 mg/kg 和 750 mg/kg [ 24 ] 。KS-Fs 口服和静脉注射的 LD50 均没有测出,口服最大耐受量大于 2.8 g/kg ,静脉注射最大耐受剂量则大于 750 mg/kg ,动物均无异常表现。治疗剂量连续静脉注射两周,对动物体质量和血象、骨髓均无影响。可见 KS-Fs 比苦参碱毒性更小,更为安全。
本实验的研究结果证明 KS-Fs 和 Kur 是安全有效的中药抗肿瘤有效部位(单体),极有可能像苦参碱一样开发成新的抗肿瘤植物药。
References 1. State Administration of Traditional Chinese Medicine. Chinese herbal medicine[M]. Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers, 1999. 634-643. Chinese. 2. Kyogoku K, Hatayama K, Komatsu M. Constituents of Chinese crude drug "Kushen" (the root of Sophora flavescens Ait.). Isolation of five new flavonoids and formononetin[J]. Chem Pharm Bull, 1973, 21(12) : 2733-2738. 3. Zhao YY, Wang B, Lei LM, et al. Constituents of the flavonoids from the roots of Sophora flavescens[J]. Zhi Wu Xue Bao, 1993, 35(4) : 304-306. 4. Ryu SY, Kim SK, No Z, et al. A novel flavonoid from Sophora flavescens[J]. Planta Med, 1996, 62(4) : 361-363. 5. Woo ER, Kwak JH, Kim HJ, et al. A new prenylated flavonol from the roots of Sophora flavescens[J]. J Nat Prod, 1998, 61(12) : 1552-1554. 6. Kuroyanagi M, Arakawa T, Hirayama Y, et al. Antibacterial and antiandrogen flavonoids from Sophora flavescens[J]. J Nat Prod, 1999, 62(12) : 1595-1599. 7. Kang TH, Jeong SJ, Ko WG, et al. Cytotoxic lavandulyl flavanones from Sophora flavescens[J]. J Nat Prod, 2000, 63(5) : 680-681. 8. Ko WG, Kang TH, Kim NY, et al. Lavandulyl flavonoids: a new class of in vitro apoptogenic agents from Sophora flavescens[J]. Toxicol In Vitro, 2000, 14(5) : 429-433. 9. Ding PL, Chen DF, Bastow KF, et al. Cytotoxic isoprenylated flavonoids from the roots of Sophora flavescens[J]. Helvetica Chimica Acta, 2004, 87(10) : 2574-2580. [Sciencepaper Online] 10. Kim YK, Min BS, Bae KH. A cytotoxic constituent from Sophora flavescens[J]. Arch Pharm Res, 1997, 20(4) : 342-345. [DBpia] 11. De Naeyer A, Vanden Berghe W, Pocock V, et al. Estrogenic and anticarcinogenic properties of kurarinone, a lavandulyl flavanone from the roots of Sophora flavescens[J]. J Nat Prod, 2004, 67(11) : 1829-1832. 12. Ha TJ, Yang SY, Jang DS, et al. Inhibitory activities of flavanone derivatives isolated from Sophora flavescens for melanogenesis[J]. Bull Korean Chem Soc, 2001, 22(1) : 97-99. [KCSNET] 13. Kang SS, Kim JS, Xu YN, et al. Isolation of a new cerebroside from the root bark of aralia elata[J]. J Nat Prod, 1999, 62(7) : 1059-1060. 14. Chung MY, Rho MC, Ko JS, et al. In vitro inhibition of diacylglycerol acyltransferase by prenylflavonoids from Sophora flavescens[J]. Planta Med, 2004, 70(3) : 258-260. 15. Carmichael J, Mitchell JB, DeGraff WG, et al. Chemosensitivity testing of human lung cancer cell lines using the MTT assay[J]. Br J Cancer, 1988, 57(6) : 540-547. 16. Bissery MC, Guénard D, Guéritte-Voegelein F, et al. Experimental antitumor activity of Taxotere (RP 56976, NSC 628503), a Taxol analogue[J]. Cancer Res, 1991, 51(18) : 4845-4852. 17. Xu SY, Bian RL, Chen X. Pharmacological experimental methods[M]. 3rd ed. Beijing: People's Medical Publishing House, 2002. 1762. Chinese. 18. Sancéau J, Poupon MF, Delattre O, et al. Strong inhibition of Ewing tumor xenograft growth by combination of human interferon-alpha or interferon-beta with ifosfamid[J]. Oncogene, 2002, 21(50) : 7700-7709. 19. Hoi SU, Kim KH, Choi EJ, et al. P-glycoprotein (Pgp) does not affect the cytotoxicity of flavonoids from Sophora flavescens, which also have no effects on Pgp action[J]. Anticancer Res, 1999, 19(3) : 2035-2040. 20. Zhang LP, Jiang JK. Study of matrine on proliferation and differentiation of K562 cell line[J]. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi, 1999, 20(6) : 315-316. Chinese. 21. Zhou BG, Sun JZ, Su G, et al. Apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells induced by oxymatrine[J]. Zhonghua Shi Yan Wai Ke Za Zhi, 2002, 18(6) : 689-691. Chinese with abstract in English. 22. Li LJ, Chen ZQ, Zheng YY, et al. Effects of oxymatrine on human ovarian cancer cell SKOV-3 in vitro[J]. Shi Yong Zhong Liu Xue Za Zhi, 2003, 17(2) : 100-101. Chinese. 23. Wang YS. Chinese herbal drug pharmacology and application[M]. Beijing: People's Medical Publishing House, 1983. 638. Chinese. 24. Li XR. Effects of 7 alkaloids from Kudouzi on immune function in mice[J]. Zhong Cao Yao, 1987, 18(5) : 22-23. Chinese.