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Alasbimn Journal - Marcado con 99mTc de liposomas convencionales y su evaluación biológica
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Alasbimn Journal Year 13, Number 51, January 2011 / Año 13, Nº 51 ,  Enero  2011

Marcado con 99mTc de liposomas convencionales y su evaluación biológica. Article AJ 51-3.


Resumen

 

Introducción. Los liposomas son sistemas supramoleculares autoensamblables preparados ad hoc, compuestos de fosfolípidos y colesterol, diseñados para transporte de fármacos o radionucleidos. El 99mTc es el radionucleido más empleado por sus propiedades físicas apropiadas para la adquisición de imágenes y estudios en pacientes en el área de medicina nuclear (emisor gamma puro con E = 140 KeV , t1/2 = 6 horas).

Objetivo. Evaluar la potencialidad de liposomas convencionales marcados con 99mTc como agente de diagnóstico de procesos tumorales.

Método. La composición estudiada es: fosfatidilcolina, dioleilfosfatidiletanolamina y colesterol (1.1:0.4:1 relación molar). Se utilizó como agente reductor SnF2, en diferentes cantidades para optimizar el marcado. La pureza radioquímica y eficiencia de marcado se evaluaron con sistemas cromatográficos ITLC-SG FM NaCl 0,9%, ITLC-SG FM Piridina:ácido acético:agua (3:5:1.5 v/v). Se adquirieron imágenes a 1 h post inyección de los liposomas en ratones sanos y portadores de tumor mamario espontáneo.

Resultados. El liposoma marcado mostró estabilidad durante 24 h, siendo la cantidad óptima de reductor 138 µg. La mejor captación en tumor fue a 1 h post administración del radiofármaco en los estudios centellográficos.

Conclusiones. El método optimizado permite obtener liposomas marcados con 99mTc en forma sencilla, eficiente y estable. Estos radiofármacos mostraron un comportamiento fiscoquímico y biológico adecuado como agentes de diagnóstico tumoral requiriéndose estudios posteriores para su confirmación.

Palabras clave. liposomas; 99mTc; radiofármaco; centellografía.

 

1. Introducción

Los liposomas son sistemas supramoleculares autoensamblantes que poseen un compartimiento acuoso rodeado por una o varias capas de fosfolípidos. En general, los liposomas convencionales están compuestos por fosfolípidos neutros y/o negativos y colesterol (1). La estructura liposomal puede diseñarse racionalmente con alta versatilidad, por lo que son sistemas muy flexibles y su comportamiento in vivo puede ser modulado mediante el diseño de su estructura. Este hecho permite la generación de formulaciones liposomales con fines diagnósticos o terapéuticos (2-5).

El tamaño es un aspecto crítico en estos nano-vehículos ya que afecta a la incorporación de drogas y su eliminación sanguínea. Se ha determinado que para el tamaño existe una relación óptima entre la estabilidad in vivo y la eficiencia de la incorporación de drogas, siendo éste alrededor de 100 nm (6).

El marcado de liposomas con radionucleidos emisores gamma es factible y puede utilizarse como un agente de diagnóstico a través de imágenes centellogáficas (7,8). Este nano-vehículo posee varias ventajas; entre otras, para su marcaje se requieren cantidades pequeñas, en orden de nanogramos, de radionúclidos por lo que ello no interfiere con la biodistribución de los liposomas ni con los procesos fisiológicos involucrados en su distribución (9-11).

Un radiofármaco es un compuesto radiactivo utilizado para el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades humanas. El radionucleido más ampliamente utilizado en medicina nuclear con fines de diagnóstico es el 99mTc, debido a su emisión γ de 140 keV y un período de semidesintegración de 6 horas. Estas características permiten la adquisición de imágenes adecuadas con bajas dosis absorbidas y una rápida eliminación, permitiendo realizar estudios de biodistribución in vivo y farmacocinéticos de una manera no invasiva (12).

El objetivo de este trabajo consistió en el desarrollo de un radiofármaco liposomal marcado con 99mTc y la caracterización de sus propiedades fisicoquímicas y biológicas.

 

2. Método

2.1 Materiales.

Los materiales utilizados incluyeron fosfatidilcolina de huevo (Epikuron 200, Degussa), colesterol (Avanti Polar lípidos); dioloilfosfatidiletanolamina (Avanti Polar lípidos); cloroformo (Sigma); metanol (Sigma); ácido dietilentriaminopentaácetico (DTPA) (Sigma); fluoruro de estaño (SnF2 ) (Sigma); piridina (Sigma); metilcetona (Sigma); bicarbonato de sodio (Merck); cloruro de sodio (NaCl) (Merck); ITLC-SG, ketamina (Kensol); todos los reactivos fueron de calidad analítica 

2.2 Preparación de liposomas.

Los liposomas fueron preparados por el método de hand-shaken (New, 1990) el método consiste en: se prepara una solución en un balón de fosfatidilcolina de huevo : dioleilfosfatidiletanolamina: colesterol (proporción molar de 1.1:0.4:1) en una mezcla de disolventes, cloroformo: metanol (9: 1 de v/v). La fase orgánica fue retirada por rotaevaporación a 60 ºC (rotavapor Büchi 461) y el film obtenido fue secado en vacío por 12 horas (estufa de vacío), la película fosfolipídica a continuación fue hidratada con una solución de bicarbonato de sodio 0,1 M a 60 ºC y se obtuvo una suspensión primaria de liposomas multilamelares.

La reducción de tamaño fue realizada por extrusión utilizando un miniextruder y realizando 5 pasajes a través de una membrana de policarbonato de 400 nm, seguido por la extrusión a través de una membrana de policarbonato de 100 nm 5 veces más (Avanti Polar de lípidos de Inc.). La distribución de tamaños de los liposomas obtenidos fue determinada por difracción de luz de láser (Coulter LS 230).

2.3 Técnica de marcado de los liposomas y control de calidad.

El marcado de los liposomas se realizó a partir de 0,4 ml de dispersión liposomal, incubado a temperatura ambiente durante 20 minutos con 0,9 ml de una solución de pertecneciato (99mTcO4-), 222 MBq obtenida de un generador de 99Mo/99mTc (Tecnonuclear, Argentina) y como agente reductor fue utilizado fluoruro de estaño (SnF2). Para la optimización del marcado, se utilizaron diferentes cantidades de SnF2: 69µg, 138 µg y 207 µg.

La eficiencia del marcado se evaluó para cada caso determinando el porcentaje de 99mTc-liposomas (99mTc-lip) formado. La evaluación de la pureza radioquímica se determinó por cromatografía instantánea de orden ascendente en capa fina (ITLC-SG) utilizando láminas de fibra de 10 cm de longitud recubiertas sílica gel. Para cada caso se aplicó una gota pequeña (2-3 µl) de la formulación radiomarcada en un punto a 1 cm desde el final de la tira de ITLC-SG. La tira fue desarrollada con una mezcla de disolvente adecuado o solución para separar las diferentes especies que podrían estar presentes. Al frente de disolvente se permitió alcanzar aproximadamente 10 cm desde el origen, luego la franja fue cortada en diez partes de 1 cm cada una y se determinó la actividad en cada segmento en un contador de centelleo (Packard).

Las especies radioquímicas que podrían haber estado presentes fueron:

99mTc-lip, 99mTcO4-, 99mTc reducido/hidrolizado (99mTc R/D). Los sistemas de cromatografía utilizados para su discriminación fueron:

ITLC-SG, como fase móvil solución de NaCl al 0,9%: Rf de 99mTc-lip = 0; Rf de 99mTcO4-= 1; Rf 99mTc R/H = 0

ITLC-SG, como fase móvil piridina: ácido acético: agua (3:5:1.5 de v/v): Rf 99mTc-lip = 0,8-1; Rf 99mTcO4-= 1; Rf 99mTc R/H = 0

2.4 Estudios de estabilidad in vitro e in vivo.

La estabilidad in vitro del radiofármaco se evaluó para las distintas cantidades de agente reductor a 2 y 24 horas post marcado en una solución de bicarbonato de sodio 0,1 M a temperatura ambiente. La pureza radioquímica fue determinada utilizando ITLC-SG y las mismas fases móviles utilizadas en el control de calidad, debido a que las especies que podrían aparecer como producto de la descomposición del radiofármaco eran 99mTcO4- y 99mTc R/H.

Por otra parte, como una herramienta para predecir la estabilidad del radiomarcado in vivo, se desafió la transquelación del 99mTc contra diferentes concentraciones de ácido dietilentriaminopentaácetico (DTPA). Este agente de complejación fue seleccionado como una molécula modelo de competencia para el radionucleido. Para este propósito, 0,5 ml de liposomas marcados se eluyeron a través de una columna de PD10 G25 (Pharmacie), utilizando una solución salina normal como agente de elución para separar el 99mTcO4 - y el 99mTc R/H. Después de esto, 0,5 ml de la dispersión liposomal marcada y purificada fueron incubados a 37 ºC con 0,5 ml de las soluciones 100, 50 y 12,5 mM de DTPA. La pureza radioquímica fue evaluada a 1 y 2 horas en ITLC-SG con NaCl 0,9% como fase móvil, permitiendo la separación del complejo-DTPA (Rf 99mTc-DTPA = 1) de los liposomas marcados que permanecieron en el punto de aplicación (Rf 99mTc-lip. = 0).

2.5 Evaluación biológica: estudios de biodistribución y centellográficos.

Los estudios se realizaron en ratones CD1 hembra normales, con edad de ocho semanas (28-31 g, n = 3). Los ratones fueron inyectados por la vena de la cola con 0,1 ml de dispersión liposomal compuesta por 1.25 mg/ml de lípidos totales marcados con 7,4±2 MBq. Fueron sacrificados a 1 y 3 horas post inyección. Después de la disección de los distintos órganos, fluidos y tejidos que se depositaron en tubos previamente pesados, fueron pesados nuevamente para calcular el peso del órgano/tejido y la actividad en cada uno se determinó con un contador de centelleo sólido (Packard). Los resultados se expresaron como porcentaje de la dosis inyectada.

Se realizaron estudios centellográficos en una gammacámara (Sopha DSX, Buc, Francia) conectada a una estación de trabajo dedicada (Segami Corp., Baltimore, MD, USA) con las siguientes condiciones: colimador de alta resolución para energías bajas, matriz de 256 x 256 y ventana energética de 10% centrada en el fotopico del 99mTc (140 keV). Se realizaron estudios en ratones hembra CD1 normales (n=3) y con tumor de mama espontáneo (n=3), todos ellos con ocho semanas de edad (27-31 g).Se obtuvieron imágenes estáticas a 1 hora de distribución, para lo cual se inyectaron por la vena de la cola 0,1 ml de liposomas (total de lípidos 1,25 mg/ml) marcados con 10±3 MBq 99mTc. Los ratones fueron anestesiados por inyección de ketamina intraperitoneal, con una dosis de 100 mg/kg. Todos estos estudios con animales se llevaron a cabo de conformidad con el Comité de Ética local del Hospital Universitario.

 

Resultados

La distribución de tamaño liposomal fue obtenida por difracción de luz láser (figura 1). Se observó una distribución de tamaño unimodal: 81,7% del total de liposomas estaban comprendidos entre 50 y 250 de nm (p=0,05) con un tamaño medio de vesícula de 136 nm.

Figura 1- Porcentaje en número versus diámetro de partícula.
Figura 1- Porcentaje en número versus diámetro de partícula.
 
Figura 2. Porcentaje de liposomas marcados en función del tiempo.
Figura 2. Porcentaje de liposomas marcados en función del tiempo.
 

La eficiencia de marcado a 1 hora fue superior al 95% para las 3 cantidades de agente reductor estudiadas (figura 2), mientras que la estabilidad de marcado fue diferente según la cantidad de SnF2 utilizada. Se observaron purezas radioquímicas superiores al 90% para 138 y 207 µg de SnF2 y menor al 50% para 69 µg de SnF2 durante el período de estudio. También se observó que sólo a altas concentraciones de DTPA se produjo una transquelación significativa (figuras 3 y 4).

Figura 3. Estudio de transquelación a 1 hora post-inyección.
Figura 3. Estudio de transquelación a 1 hora post-inyección.
 
Figura 4. Estudio de transquelación a la 2 horas post-inyección.
Figura 4. Estudio de transquelación a la 2 horas post-inyección.
 
 
 

La biodistribución de 99mTc-lip a una hora post inyección en ratones normales mostró una alta depuración sanguínea; la actividad en sangre fue inferior al 5% y el hígado presentó la mayor captación (figura 5). En la imagen centellográfica del ratón CD1 normal a 1 hora post inyección se observa el mismo comportamiento mencionado anteriormente: el hígado presenta la mayor actividad, no observándose actividad relevante en otros órganos (figura 6). En los estudios centellográficos a una hora post inyección, en ratones con tumor espontáneo de mama, se constató alta actividad a nivel tumoral (figura 7), presentando una relación tumor/músculo de 1,7.

 
Figura 5. Estudio de biodistribución de liposomas marcados con 99mTc en ratones sanos a 1 y 3 horas post-inyección.
Figura 5. Estudio de biodistribución de liposomas marcados con 99mTc en ratones sanos a 1 y 3 horas post-inyección.
 
Figura 6. Imagen centellográfica de ratón sano CD1 a 1 hora post-inyección de liposomas marcados con 10 ± 3 MBq de 99mTc.
Figura 6. Imagen centellográfica de ratón sano CD1 a 1 hora post-inyección de liposomas marcados con 10 ± 3 MBq de 99mTc.
 
Figura 7. Imagen centellográfica de ratón CD1 con tumor mamario espontáneo a 1 hora post-inyección de liposomas marcados con 10 ± 3 MBq de 99mTc.
Figura 7. Imagen centellográfica de ratón CD1 con tumor mamario espontáneo a 1 hora post-inyección de liposomas marcados con 10 ± 3 MBq de 99mTc.
 
 

Discusión

En este trabajo, la composición de los liposomas fue diseñada con dioleilfosfatidiletanolamina para proporcionar los grupos Amino en la bicapa fosfolipídica. De esta manera, los liposomas son capaces de quelar a los radionucleidos y constituir un radiofármaco estable capaz de reducir al mínimo el intercambio de los radionucleidos con las proteínas plasmáticas. Esto se demostró a través estudios in vivo e in vitro. Estos últimos verifican la alta estabilidad de los liposomas radiomarcados frente a una molécula modelo con gran afinidad por el 99mTc. En los estudios in vivo, una alta tasa de depuración sanguínea sin captación apreciable a nivel del pool demuestra la estabilidad del radiomarcado.

El método óptimo de marcado es aquel que genera un radiofármaco estable con la menor cantidad de agente reductor (13-16).

El marcado estable de los liposomas obtenidos con la composición de lípidos elegida y la técnica optimizada permite un seguimiento adecuado del nano-vehículo. La técnica optimizada permite la formulación deseada del radiofármaco en una forma rápida, fácil y eficiente.

En los estudios centellográficos de biodistribución realizados en ratones normales observamos que la eliminación de los liposomas se realiza principalmente por el hígado y no existe captación significativa por otros órganos (17). Cuando el radiocompuesto no es estable in vivo, es apreciable una captación en tiroides y estómago; en nuestro estudio estos órganos no fueron observados en las imágenes centellográficas realizadas. Como era esperable, no hubo acumulación en la vejiga, debido a que el tamaño liposomal desarrollado no permite la excreción renal. En los estudios in vivo, la estabilidad es fundamental y no resulta fácil lograr el diseño adecuado del radiofármaco. Hay estudios que muestran captación a nivel de vejiga después de la inyección de liposomas convencionales radiomarcados (18) lo cual obligó a diseñar liposomas galactosilados para lograr la estabilidad in vivo.

Con el fin de evaluar el rendimiento in vivo de estos nanosistemas, se utilizó un modelo de cáncer de mama espontáneo en ratones CD1; estos son tumores sólidos poco irrigados. En los estudios centellográficos se observó una relación tumor/músculo de 1,7 a una hora post inyección lo cual probablemente traduce la acumulación de estos nanosistemas en procesos angiogénicos en zonas periféricas del tumor, asociados a procesos inflamatorios que producen la ruptura de vasos sanguíneos y extravasación de los nanovehículos.

Conclusión

Los liposomas diseñados mostraron propiedades fisicoquímicas y biológicas adecuadas para su uso como agentes de diagnóstico tumoral. Estudios adicionales utilizando modelos de tumor diferentes permitirían la confirmación de estas observaciones preliminares.

 

References

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