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Revista chilena de infectología - Análisis molecular de la resistencia a fluoroquinolonas y macrólidos en aislados de Campylobacter jejuni de humanos, bovinos y carne de ave

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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. vol.30 no.2 Santiago abr. 2013

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182013000200003 

Microbiología
Artículo Original

 

Análisis molecular de la resistencia a fluoroquinolonas y macrólidos en aislados de Campylobacter jejuni de humanos, bovinos y carne de ave

Molecular analysis of fluoroquinolones and macrolides resistance in Campylobacter jejuni isolates from humans, bovine and chicken meat

 

Gisela González-Hein, Ninoska Cordero, Patricia García y Guillermo Figueroa

Universidad de Chile.
Instituto de Nutrición y Tecnología de Alimentos-INTA. Laboratorio de Microbiología y Probióticos (GGH, NC, GF).

Pontificia Universidad Católica de Chile.
Escuela de Medicina. Departamento de Laboratorios Clínicos. Laboratorio de Microbiología (PG).

Correspondencia a:


Background: Campylobacter sp.- one of the leading causes of bacterial food-borne gastrointestinal illness worldwide- is increasingly resistant to fluoroquinolone and macrolide antimicrobials, which has become a major concern for public health. Objective: To describe the susceptibility patterns of Campylobacter jejuni strains to erythromycin and ciprofloxacin and to explore the origin of its resistance in human isolates. Material and Method: In this study, fifty-five ciprofloxacin and erythromycin susceptibility patterns of C. jejuni strains isolated from humans with diarrheal disease, performed by broth microdilution MIC, were compared with 55 and 44 isolates from chicken meat and bovines respectively, obtained from the Metropolitan Region, Chile. Results: Of the 55 human isolates of C. jejuni, 33 (60%) were resistant to ciprofloxacin and all were sensitive to erythromycin. Of the 55 isolates from chicken meat, 32 (58.2%) were resistant to ciprofloxacin and 1.8% were resistant to erythromycin. Of the 44 isolates of C. jejuni from cattle, 8 (18.2%) were resistant to ciprofloxacin and all were sensitive to erythromycin. Four PFGE patterns matched with certain resistance profiles and grouped isolates from human and animal. Conclusion: The findings showed continued effectiveness of erythromycin for campylobacteriosis and a high percentage of C. jejuni strains ciprofloxacin-resistant. This is interesting because it is considered that the presence of ciprofloxacin resistant strains in broiler meat can be in part the source of resistance to this antimicrobial in humans.

Key words: Campylobacter jejuni; chicken; bovine, human; resistance, ciprofloxacin, erythromicin.


Resumen

Introducción: El incremento de la resistencia en Campylobacter sp. (una de las principales causas de gastroenteritis bacteriana de origen alimentario) a fluoro-quinolonas y macrólidos, es un problema en salud pública. Objetivo: Conocer los patrones de susceptibilidad in vitro de Campylobacter jejuni a eritromicina y ciprofloxacina y conocer el origen de su resistencia en aislados de humanos. Material y Método: En este estudio, se compararon las susceptibilidades a ciprofloxacina y eritromicina -CIM efectuadas por microdilución en caldo- de 55 aislados de C. jejuni provenientes de humanos con enterocolitis, con 55 aislados de carne de pollo y 44 de bovinos obtenidos en la Región Metropolitana, Chile. Resultados: De 55 aislados de C. jejuni de humanos, 33(60%) presentaron resistencia a ciprofloxacina y todos presentaron susceptibilidad a eritromicina. De 55 aislados procedentes de carne de pollo, 32 (58,2%) presentaron resistencia a ciprofloxacina y un aislado resultó resistente a eritromicina (1,8%). De 44 aislados de bovinos, 8(18,2%) presentaron resistencia a ciprofloxacina y todos resultaron sensibles a eritromicina. Cuatro patrones de electroforesis a campo pulsado coincidieron en sus perfiles de resistencia y agruparon aislados de origen humano y animal. Conclusiones: Los resultados muestran que eritromicina continúa siendo efectiva para el tratamiento de la campilobacteriosis y que existe un alto porcentaje de cepas resistentes a ciprofloxacina. Se considera probable que la presencia de cepas resistentes a ciprofloxacina en la carne de pollo puede ser en parte el origen de la resistencia a este fármaco en humanos.

Palabras clave: Campylobacter jejuni; pollos, bovinos, humanos, resistencia, ciprofloxacina, eritromicina.


Introducción

Campylobacter jejuni es uno de los principales agentes causales de gastroenteritis bacteriana en humanos1-3. La campilobacteriosis por C. jejuni se asocia al consumo de alimentos o agua contaminada, siendo los pollos, pavos, bovinos y ovinos los principales reservorios1,4. A pesar que la campilobacteriosis humana es, por lo general, una enfermedad autolimitada, la terapia antimicrobiana es necesaria en casos graves y prolongados5. En la actualidad, macrólidos y fluoroquinolonas son considerados los antimicrobianos de primera y segunda elección, respectivamente, en el tratamiento de la campilobacteriosis. Sin embargo, en los años recientes, la emergencia de resistencia a estos grupos de antimicrobianos ha complicado el tratamiento empírico de la campilobacteriosis6,7. En los últimos años, se produjo un incremento en la resistencia del C. jejuni a fluoroquinolonas en aislados de C. jejuni en humanos, alcanzando frecuencias de 32,4 y 46,6% en Chile8-10, situación que también se ha dado en otros países11-13. En el ámbito nacional, fluoroquinolonas y macrólidos están autorizados para su uso en medicina veterinaria, de acuerdo con el registro de Medicamentos Veterinarios del Servicio Agrícola y Ganadero14 y también se usan en medicina humana. Se sabe también que en el país, la cantidad de antimicrobianos del grupo de las quinolonas y fluoroquinolonas destinada para uso en medicina veterinaria es muy superior al que se usa en medicina humana15.

La determinación precisa de la susceptibilidad in vitro de Campylobacter sp., es de vital importancia para garantizar una terapia antimicrobiana adecuada de los pacientes con formas graves de la enfermedad y, también, para el monitoreo eficaz de la resistencia a los antimicrobianos en Campylobacter spp. a nivel mundial7. Los estudios de susceptibilidad antimicrobiana en aislados de Campylobacter spp., descritos por el Instituto de Estandarización Clínico y de Laboratorio (Clinical and Laboratory Standards Institute-CLSI) han precisado los puntos de corte y estandarizado los métodos de dilución en agar y dilución en caldo16-18. Otros métodos como el E-test® han dado resultados comparables y reproducibles19, no así la difusión en agar por disco7.

Un elemento crucial en el reconocimiento y control de enfermedades es la capacidad de analizar los patógenos aislados de humanos y de identificar las fuentes probables de contaminación hasta llegar al reservorio y vías de transmisión. Para realizar estos análisis se requieren metodologías de biología molecular que permiten establecer las similitudes genéticas entre las bacterias aisladas. En este contexto, los Centros para el Control de las Enfermedades y Prevención, de Estados Unidos de América- E.U.A., han desarrollado una red nacional de sub-tipificación molecular para la vigilancia de las enfermedades transmitidas por los alimentos, llamada PulseNet. Ésta se ha expandido a otras regiones del mundo como Canadá, Asia, África, Europa, Medio Oriente, América Latina y el Caribe y se ha basado para la sub-tipificación de las bacterias patógenas en la técnica de la electroforesis en gel de campo pulsado (EGCP) que consiste en la migración de fragmentos de ADN a través del gel de agarosa, como consecuencia de un cambio constante del campo eléctrico durante la electroforesis20.

Con los objetivos de determinar los patrones de susceptibilidad in vitro a ciprofloxacina y eritromicina (antimicrobianos de importancia crítica humana, de acuerdo a la Organización Mundial de la Salud21) y de conocer el origen de la resistencia en los aislados humanos de nuestra área geográfica (Región Metropolitana-RM), se compararon aislados de humanos con enterocolitis con los provenientes de carne de pollo y de bovinos que proveían a la región, mediante su caracterización fenotípica y molecular.

Material y Método

El presente estudio, retrospectivo, consistió en un análisis microbiológico y molecular de cepas de C. jejuni aisladas de humanos, pollos y bovinos.

Cepas bacterianas: se estudiaron 55 cepas de C. jejuni provenientes de pacientes con cuadros diarreicos (43 cepas de pacientes pediátricos ≤ 14 años de edad y 12, de pacientes >14 años), 44 de hisopados rectales de bovinos y 55 de carne de pollo industrial aisladas entre los años 2006 y 2010 en la R.M. Las cepas fueron recuperadas de cepario en agar Skirrow con el factor de crecimiento FBP22 e incubadas en microaerofilia a 42°C por 48 h. La confirmación de las cepas de C. jejuni se realizó por las características de la colonia, características a la tinción, hidrólisis de hipurato y por la prueba de reacción de polimerasa en cadena (RPC) que amplifica el gen potencial de la oxido-reductasa23.

Estudio de susceptibilidad in vitro: se realizó mediante la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) por el método de microdilución en caldo acorde a las recomendaciones del CLSI16-18. En breve, se usaron microplacas estériles de 96 pocillos con fondo cónico y con tapas y como medio, caldo Mueller Hinton ajustado de cationes y suplementado con sangre de caballo lisada (2,5%)16. Se prepararon inóculos de los aislados de C. jejuni equivalentes a 0,5 McFarland para luego llevarlos a una concentración en el pocillo de 5 x 105 ufc/ml siguiendo los procedimientos descritos en el documento M07-A818. El volumen del inóculo en cada pocillo fue de 10 μL. Los antimicrobianos evaluados fueron eritromicina y ciprofloxacina, ensayándose concentraciones entre 1 y 512 μg/mL y 1 y 128 μg/mL, respectivamente. En todas las microplacas se usó además C. jejuni ATCC® 33560 como cepa control en la determinación de la CIM. Se incluyeron, además, pocillos controles de esterilidad (medio sin inoculo, ni antimicrobiano) y un pocillo control de multiplicación de cada aislado (medio sin antimicrobiano más el inoculo de la bacteria). Las microplacas fueron incubadas por 48 h a 37°C en microaerofilia. Los puntos de corte que se utilizaron corresponden a los descritos para este patógeno en el documento M45A, del CLSI, 2006 (Tabla 1)16.


Tabla 1. Puntos de corte para los antimicrobianos ensayados (M45A CLSI, 2006)

Análisis estadístico. Posteriormente se usó la prueba de χ2 o Fisher, para comparar las proporciones de aislados resistentes según origen. Dado que la prueba χ2 requiere que las frecuencias esperadas en cada celdilla no sean demasiado bajas, al obtener frecuencias esperadas menores de 5, en las tablas de contingencias 2 x 2, se usó la prueba de Fisher24.

Estudio molecular de C. jejuni: para caracterizar los patrones de macrorestricción de los aislados de C. jejuni de diversos orígenes en función a su patrón de resistencia, se usó EGCP con la enzima SmaI acorde a la metodología recomendada por PulseNet25. El revelado de los patrones de macrorestricción se realizó por corrida en gel de aga-rosa con bromuro de etidio y transiluminación en UV. Se interpretó a los aislados con pulsotipos o patrones EGCP SmaI diferentes cuando diferían en una banda26.

Resultados

De los 55 aislados de C. jejuni de humanos, 33 (60%) presentaron resistencia a ciprofloxacina y todos presentaron sensibilidad a eritromicina. De los 55 aislados procedentes de carne de pollo, 32 (58,2 %) presentaron resistencia a ciprofloxacina y un aislado resultó resistente a eritromicina (1,8%). De los 44 aislados de C. jejuni de bovinos, ocho (18,2%) presentaron resistencia a ciprofloxacina y todos resultaron sensibles a eritromicina. Sólo una de las 154 cepas evaluadas presentó resistencia a ambos antimicrobianos (Tabla 2).


Tabla 2. Susceptibilidad antimicrobiana de cepas de Campylobacter jejuni de diverso origen aisladas en la Región Metropolitana de Chile (n: 154)

La proporción de aislados resistentes a ciprofloxacina varió según su origen (p < 0,05), siendo menor en bovinos. La presencia de aislados resistentes a eritromicina fue independiente del origen del aislado (p > 0,05).

Se obtuvieron 93 diferentes patrones EGCP SmaI25, de los cuales 11 patrones mantuvieron aislados con los mismos perfiles de resistencia y CIMs. De los 11 patrones EGCP, tres compartieron aislados de origen humano y de pollos y uno compartió aislados de origen bovino y humano (Figura 1).


Figura 1. Aislados de C. jejuni de orígenes diversos que se caracterizaron por compartir los mismos patrones EGCP SmaI y concentraciones inhibitorias mínimas para ciprofloxacina y eritromicina. EGCP: electroforesis en gel de campo pulsado. PC: aislados de pollo. HC: aislados humanos. BC: aislados de bovinos. *Que comparten aislados de origen humano y animal. Los patrones EGCP SmaI, fueron enviados a publicación a la revista Cyta J Food, doi: 10.1080/19476337.2012.72256426.

Discusión

La proporción de cepas resistentes a fluoroquinolonas ha aumentado rápidamente27 ocasionando un problema mundial en el tratamiento de la enteritis en general y particularmente por Campylobacter spp11. En Agentina, Japón y países europeos, el porcentaje de resistencia a quinolonas en humanos bordea o supera el 60%11-13. Las frecuencias altas y muy similares (p > 0,05) de resistencia a ciprofloxacina encontradas en el presente estudio en aislados de humanos (60%) y de pollos broiler (58,2%) son concordantes a las reportadas en países de Europa y Argentina y parecen ser consistentes con la opinión científica muy difundida que las aves de corral son la fuente más importante de campilobacteriosis humana por C. jejuni12. Variadas publicaciones han asociado el aumento de la resistencia de Campylobacter spp., a fluoroquinolonas con la introducción de estos fármacos en la industria avícola, principalmente de enrofloxacina, cuyo metabolito activo es ciprofloxacina8,12,28-30. Países como Australia no han permitido el uso de fluoroquinolonas en producción animal destinada al consumo y reportan una baja resistencia a fluoroquinolonas (3,2%) en aislados de Campylobacter de origen humano, donde los casos de aislados resistentes fueron atribuidos a viajes31. En Dinamarca, el empleo de fluoroquinolonas en la producción de pollos fue restringido. En el año 2002, el uso de fluoroquinolonas en la producción de pollos broiler decreció significativamente y ese año, acorde con el Programa Danés Integrado de Vigilancia e Investigación de Resistencia Antimicrobiana (DANMAP) no fueron aisladas cepas resistentes a quinolonas en pollos broiler32.

En la presente investigación, en humanos, la resistencia a ciprofloxacina se encontró en aislados principalmente de pacientes pediátricos (73%) en los cuales no se recomienda usar las fluoroquinolonas como tratamiento empírico de diarrea. Dada esta situación, la probabilidad de adquisición de este tipo de resistencia intra-tratamiento es escasa, y es más probable que la infección fuese provocada por cepas de C. jejuni ya resistentes.

En contraste, las frecuencias de resistencia en cepas de origen humano a eritromicina son bajas y concordantes también con las de países europeos y las reportadas previamente en Chile8-9. Esto podría explicarse por el hecho que la selección de resistencia a macrólidos durante el tratamiento con este grupo de antimicrobianos es infrecuente32. Sin embargo, ya que los macrólidos se usan en medicina humana y frecuentemente en medicina veterinaria21, especialmente en reservorios de Campylobacter spp., existe un riesgo de emergencia de resistencia. Lamentablemente, están aumentando las frecuencias de resistencia a macrólidos en varios países, lo que para E.U.A., Europa y Taiwán comienza a ser un problema de salud pública mayor34.

En el presente estudio, la presencia de aislados resistentes puede deberse probablemente a la participación de uno o más de los diversos mecanismos responsables de resistencia descritos para las fluoroquinolonas y los macrólidos en Campylobacter spp. Referente a los mecanismos genéticos responsables de resistencia detectados en C. jejuni se ha reportado que la presión selectiva de fluoroquinolonas conduce rápidamente a resistencia antibacteriana29. En C. jejuni la resistencia a fluoroquinolonas se genera por mutaciones puntuales en la región determinante de resistencia a quinolonas del gen gyrA. La bomba de eflujo CmeABC también se ha sido identificada como un sistema de resistencia a fluoroquinolonas30 y la sobre-expresión del gen mfd (que codifica para la proteína Mfd que participa en el mecanismo de reparación del AlDN en el proceso de la transcripción), podría incrementar la aparición espontánea de mutantes resistentes a fluoroquinolonas35. Para la resistencia a eritromicina, se describe en Campylobacter spp., una mutación cromosomal que genera una modificación en el sitio blanco del ribosoma (A2075 → G del gen 23S ARNr). La bomba de eflujo CmeABC actuaría sinérgicamente con las mutaciones de la zona 23S ARNr aumentando drásticamente las CIMs para eritromicina y tilosina en Campylobacter colP6.

La relación génica estrecha entre aislados de C. jejuni de origen humano y de origen animal (carne de pollo y bovinos) fue ya reportada en el país por nuestro equipo de investigación26. Al analizar los patrones de EGCP SmaI generados26 con los resultados de susceptibilidad antimicrobiana del presente estudio, observamos que ciertos patrones de EGCP, indistinguibles entre ellos, coincidieron también en sus fenotipos de resistencia y que algunos de ellos compartieron aislados de origen humano y animal. En otros países, ya se ha mostrado que ciertos genotipos de C. jejuni se han relacionado con determinados patrones de susceptibilidad antimicrobiana37, 38 y que los mismos genotipos de C. jejuni circulan entre hombre y animales domésticos4,39.

Las similitudes encontradas en las tasas de resistencia a antimicrobianos, como también la detección de los mismos pulsotipos y patrones de resistencia en aislados de C. jejuni de origen humano y de pollos broiler, sugieren que estos últimos podrían actuar como una importante fuente de contagio para los humanos en nuestro país. Es requerida mayor investigación sobre otras fuentes potenciales de campilobacteriosis en el país como también la inclusión de C. jejuni en evaluaciones de riesgo, considerando especialmente la matriz alimentaria, carne de ave.

Los resultados del presente estudio enfatizan además en la trascendencia de mantener una vigilancia rigurosa de la resistencia a antimicrobianos de importancia crítica humana, en cepas de C. jejuni de origen humano como también en los aislados de origen animal (especialmente en pollo broiler) y del ambiente.

Agradecimientos. A Juan Carlos Román del Laboratorio de Microbiología, Escuela de Medicina, de la Pontificia Universidad Católica de Chile y a Miriam Troncoso del Laboratorio de Microbiología y Probióticos del INTA, Universidad de Chile quienes colaboraron en la presente investigación y a las Becas Apoyo Realización Tesis Doctoral, CONICYT y Becas para Estudio de Doctorado en Chile, CONICYT.

 

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Declaramos no tener conflictos de interés.

Financiamiento: Beca para Estudio de Doctorado en Chile, CONICYT y Beca para Estudio de Doctorado en Chile, CONICYT

Recibido: 12 de noviembre de 2012 Aceptado: 4 de febrero de 2013

Correspondencia a: Gisela González-Hein gighein@yahoo.es