Distribuição de genes cry de Bacillus thuringiensis isolados de solos do Estado do Rio Grande do Sul, Brasil

 

Distribution of cry genes of Bacillus thuringiensis isolated from soils of the State of Rio Grande do Sul, Brazil

 

 

Laura Massochin Nunes Pinto^{I, 1}; Lidia Mariana Fiuza^II

^IBiólogo, Mestre, Universidade do Vale do Rio dos Sinos (UNISINOS), Laboratório de Microbiologia, Centro 2. CP 275, 93001-970, São Leopoldo-RS. Fone: (51) 590 3333. Ramal 1213. Fax: (51) 590 8122. E-mail: lau@pro.via-rs.com.br
^IIEngenheiro Agrônomo, PhD., UNISINOS e EEA/Instituto do Riograndense do Arroz

 

 

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RESUMO

A bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) caracteriza-se pela produção de proteínas tóxicas a representantes de diversas ordens de insetos, as quais são codificadas por genes cry. Devido a esta característica, mais de 40.000 cepas de Bt foram isoladas e cerca de 190 genes cry, caracterizados. Como os dados sobre Bt são limitados no Rio Grande do Sul, essa pesquisa objetivou avaliar a distribuição de seis famílias de genes cry de Bt, desse estado, que codificam proteínas ativas contra insetos-praga. O perfil dos 46 isolados de solos do Rio Grande do Sul foi avaliado, por PCR com os primers que detectam os genes cry1, cry2, cry3, cry7 cry8 e cry9 e suas respectivas proteínas foram analisadas por SDS-PAGE a 10%. A presença de genes cry9 foi detectada em 47,82% dos isolados, seguido de cry3 (15,21%), cry1 e cry7 (ambos com 6,52%) e cry2 (2,17%). Oito perfis genéticos foram identificados, sendo o perfil cry9 (39,13%) o mais freqüente. A análise protéica de Bt identificou 14 famílias de proteínas Cry possivelmente codificadas por genes presentes nos isolados, além de proteínas desconhecidas que podem caracterizar novos genes cry. Esses isolados revelam a presença de genes que codificam proteínas específicas contra lepidópteros e coleópteros, as quais poderão ser avaliadas quanto à toxicidade in vivo contra insetos-praga das plantas cultivadas.

Palavras-chave: controle biológico, entomopatógenos, bactérias, PCR.

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ABSTRACT

The Bacillus thuringiensis (Bt) bacterium is characterized by the production of toxic protein to representatives of several insect orders, which are coded by cry genes. Due to this characteristic, more than 40.000 Bt strains were isolated and around 190 cry genes characterized. As the data on Bt are limited in Rio Grande do Sul, this research aimed the evaluation of the distribution of six Bt families of cry genes, in this state, that codify active proteins against insect-pest. The 46 isolates profiles of soil samples from Rio Grande do Sul were evaluated, by PCR with primers that detect cry1, cry2, cry3, cry7, cry8 and cry9 genes, and its respective proteins were analyzed by SDS-PAGE 10%. The presence of cry9 genes were detected in 47.82% of the isolates, followed by cry3 (15.21%), cry1 and cry7 (both with 6.52%) and cry2 (2.17%). Eight genetic profiles were identified, being the profile cry9 (39.13%) the most frequent one. The Bt proteic analysis identified 14 families of Cry protein that are possibly coded by the genes in these isolates, besides the unknown proteins that can characterize new cry genes. These isolates reveal the presence of genes that codify specific proteins against lepidopterans and coleopterans, which can be evaluated for its in vivo toxicity against insect-pest of the cultivated plants.

Keywords: biological control, entomopathogen, bacterial, PCR.

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INTRODUÇÃO

A contaminação ambiental, incluindo pesticidas na agricultura, tem aumentado a cada ano (SINDAG, 2002), o que tem levado à busca de novas alternativas para o controle de insetos. Nesse contexto, os patógenos, predadores e parasitóides representam ferramenta importante no controle de pragas (ATLAS & BARTHA, 1998).

Bacillus thuringiensis (Bt) é um agente de controle microbiano, cuja principal característica é a produção de cristais inseticidas durante sua esporulação. Estes cristais consistem em proteínas codificadas por diferentes genes, denominados cry, os quais conferem ação tóxica de Bt a insetos de diversas ordens, principalmente Lepidoptera, Diptera e Coleoptera (HÖFTE & WHITELEY, 1989). Mais de 40.000 cepas de Bt foram isoladas e cerca de 190 genes cry caracterizados. (http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/ Bt/). As propriedades entomopatogênicas desta bactéria têm impulsionado pesquisas para selecionar isolados de Bt com atividade tóxica para diferentes espécies de insetos (SCHNEPF et al., 1998). A busca de genes que sintetizam proteínas inseticidas de Bt tem sido feita pela Reação da Polimerase em Cadeia (PCR), técnica molecular valiosa para a predição da atividade inseticida de novos isolados.

Essa pesquisa objetivou detectar e avaliar a distribuição de seis famílias de genes cry de Bt, já conhecidos como específicos às ordens Lepidoptera (cry1, cry2 e cry9) e Coleoptera (cry3, cry7 e cry8) a partir de amostras de solos do Rio Grande do Sul.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Isolados bacterianos

As cepas Bt tenebrionis cry3A e Bt aizawai HA3, utilizadas como controle positivo, foram fornecidas pelo Instituto Pasteur (França) e os demais 46 isolados de Bt utilizados foram obtidos de 29 amostras de solos de áreas cultivadas com arroz irrigado, em dez municípios do Rio Grande do Sul, de julho a novembro de 1999 (ANTONIO et al., 2001).

Preparo das amostras e PCR

Os isolados de Bt foram cultivados em Ágar Nutriente, durante 12 horas, a 30°C, e foi realizada a extração de DNA total (HANSEN & HENDRIKSEN, 2001). Os seis pares de primers utilizados, visando à detecção de genes cry1, cry2, cry9 (específicos para lepidópteros) e cry3, cry7, cry8 (específicos para coleópteros), foram descritos por BEN-DOV et al. (1997, 1999) e BRAVO et al. (1998). A amplificação foi realizada em termociclador regulado para 35 ciclos de reação cada. As reações foram realizadas em volumes de 25µL que consistiam em 1µL de amostra de DNA com o tampão de reação, 0,2 mM de cada dNTP, 0,2 a 0,5 µM de cada primer e 0,5U de Taq DNA polymerase (GIBCO-BRL). As amostras foram desnaturadas durante um minuto a 94°C, aneladas aos primers por 40-50s a 60°C e a extensão dos produtos da PCR foi realizada por 50-90s a 72°C. Como controle positivo, os experimentos foram associados a amostras de Bt caracterizadas molecularmente e um controle negativo, sem adição de DNA. Os fragmentos obtidos foram analisados em gel de agarose a 1 e 1,5%.

Análise protéica por SDS-PAGE

A composição do complexo esporo-cristal foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida de sódio dodecyl sulfato a 10%. Uma alíquota bacteriana, crescida em Ágar Nutriente, foi cultivada em meio LB por 48h, para cada isolado. As amostras foram preparadas com 15µL das suspensões bacterianas, 0,125M Tris-Cl pH6,8, 4% SDS, 20% Glicerol, 10% Mercaptoetanol e 0,1% Bromofenol Blue, aquecidas a 100°C por 10 min e centrifugadas 10.000 rpm por 30s. O SDS-PAGE foi realizado de acordo com o método descrito por LAEMMLI (1970).

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados de PCR revelaram amplificações de fragmentos de DNA semelhantes aos controles positivos para genes cry1, cry2, cry3, cry7 e cry9, mas os genes cry8 não foram detectados (Figura 1). Os isolados contendo genes cry9 foram mais abundantes, representando 47,82% dos isolados analisados, seguido de cry3 (15,21%), cry1 e cry7 (ambos com 6,52%) e cry2 (2,17%).

Os isolados que não foram amplificados por PCR com nenhum dos seis pares de primers de genes cry, mas identificados por microscopia com inclusões cristalinas, totalizaram 36,95% das amostras. Isto sugere a presença de isolados de B. thuringiensis com genes não identificados pelos primers ou novos genes cry ainda não caracterizados.

A freqüência de genes cry9, encontrada neste trabalho, difere dos resultados de BRAVO et al. (1998) que encontraram apenas, 2,60% dos isolados com esse gene e também da freqüência de 10,20% de BEN-DOV et al. (1997). Os genes cry1 foram encontrados em apenas 6,52% dos isolados, diferindo de BRAVO et al. (1998), que relataram a presença do mesmo em 49,50% das amostras de B. thuringiensis. Os genes cry3 tiveram a segunda maior freqüência, de forma semelhante aos resultados de BRAVO et al. (1998), que encontraram 21,70% destes genes nos isolados analisados. Mas BEN-DOV et al. (1997) não identificaram esses genes. A distribuição de genes cry no Rio Grande do Sul, comparada a outras regiões geográficas, revelou diferenças que podem estar associadas a fatores abióticos, como características físico-químicas do solo, as quais não foram avaliadas nessas pesquisas.

A maioria dos isolados de Bt apresenta diversos genes cry em diferentes combinações. Neste trabalho, foi analisado o perfil genético e protéico dos isolados. O perfil genético foi avaliado quanto à distribuição dos genes cry entre os isolados. A tabela 1 mostra os oito perfis genéticos obtidos e sua freqüência entre os 46 isolados analisados. A ocorrência dos genes cry9 foi observada como o perfil único em 39,13% dos isolados e também associada à presença dos demais genes cry detectados. Entretanto, os genes cry1 e cry2 foram encontrados somente em perfis associados com outros genes, sem ocorrência isolada.

 

 

A análise protéica por SDS-PAGE dos isolados de Bt mostrou perfis altamente variáveis, com a identificação de 14 classes de proteínas Cry que possivelmente sejam codificadas pelos isolados analisados (Tabela 2), através de comparações entre os pesos moleculares obtidos e os pesos conhecidos para as proteínas Cry.

Diversas outras proteínas que não correspondem às proteínas Cry já conhecidas (SCHNEPF et al., 1998) foram encontradas, o que pode representar novos genes cry ainda não conhecidos. Além disso, quatro isolados apresentaram várias bandas pequenas com baixo peso molecular, que pode ser devido à degradação das proteínas do cristal de Bt (OHBA et al., 1987).

Os isolados de Bt de solos do Rio Grande do Sul apresentaram grande diversidade de genes cry, com cinco famílias identificadas molecularmente, além da caracterização de proteínas que indicam a presença de novos perfis genéticos e protéicos dessa bactéria.

 

AGRADECIMENTOS

À UNISINOS, ao Instituto Riograndense do Arroz e à FAPERGS, pelo apoio financeiro.

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANTONIO, A.C. et al. Levantamento de bactérias entomopatogênicas em amostras de solos de áreas orizícolas do Rio Grande do Sul. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ARROZ IRRIGADO, 2 e REUNIÃO DA CULTURA DO ARROZ IRRIGADO, 24, 2001, Porto Alegre. Anais... Porto Alegre, RS: Instituto Rio Grandense do Arroz, 2001. p.255.        [ Links ]

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Recebido para publicação 01.04.02
Aprovado em 03.07.02

 

 

1 Autor para correspondência