Li XB, He XJ, Liu B, Xu L, Ju DH, Jiang M, Lu AP. J Chin Integr Med. 2010; 8(4): 363-367. Received December 16, 2009; accepted February 8, 2010; published online April 15, 2010. Indexed/abstracted in and full text link-out at PubMed. Journal title in PubMed: Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. Free full text (HTML and PDF) is available at http://www.jcimjournal.com.  Forward linking and reference linking via CrossRef. DOI: 10.3736/jcim20100411

Correspondence: Ai-ping LU, MD, Professor; Tel: 010-64014411; E-mail: lap64067611@126.com

基金项目: “十一五”国家科技支撑计划资助项目(No. 006BAI08B01-01); 国家自然科学基金资助项目(No. 30902003)； 中国中医科学院课题基金资助项目（No. Z02116）

     甘草为豆科甘草属的多年生草本植物，其根和茎是最常用的药物，味甘，性平，归心、肺、脾、胃经^［1］，《本草汇言》谓其能“健脾胃，固中气之虚赢；协阴阳，和不调之营卫”，具有扶助正气的功能。甘草多糖是从甘草中提取出的活性多糖，近年来，对甘草多糖的药理作用进行了广泛的研究，发现甘草多糖具有调节机体免疫、抗肿瘤等功能^［2-4］。这些研究多集中于巨噬细胞等非特异性免疫细胞。国内外还未见有甘草多糖对调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）影响的报道。为探讨Treg细胞与肿瘤的发病关系以及甘草多糖对荷瘤小鼠的免疫指标的影响，我们通过对小鼠腋窝注射H22瘤株建立荷瘤鼠，以甘草多糖进行干预，用流式细胞术和四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法分别检测脾脏Treg细胞及脾淋巴细胞转化率的变化。

1  材料与方法
1.1  实验材料
1.1.1  实验动物  SPF级BALB/c雄性小鼠，体质量20～22 g，50只，由中国中医科学院实验动物研究中心提供。动物饲养和实验均在中国中医科学院实验动物研究中心进行，动物许可证号为SCXK(京)2005-0004。
1.1.2  细胞系  肝癌细胞株H22，由中国中医科学院中药研究所戴宝强老师赠送。
1.1.3  药物及试剂  甘草多糖（Radix Glycyrrhizae polysaccharide, GP），由美国泛华公司北京代表处提供，纯度95%；注射用环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)，江苏恒瑞医药股份有限公司产品；大鼠抗小鼠藻红蛋白（phycoerythrin, PE）-Cy5-CD4、PE-CD25、Alexa Fluor 488-Foxp3抗体，Biolegend公司产品；Foxp3固定破膜试剂盒，eBioscience公司产品；胎牛血清和RPMI 1640培养基，Hyclone公司产品；MTT，Amresco公司产品；牛血清白蛋白和二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO），Sigma公司产品。
1.2  实验方法
1.2.1  动物模型及分组  50只小鼠按随机数字表随机分为正常组、模型组、CTX组、甘草多糖组、甘草多糖加CTX组。正常组小鼠正常饲养，不做处理，无肿瘤负荷。余下的40只造模，将H22腹水瘤小鼠乳白色浓稠腹水，用生理盐水稀释至2×106个/mL且活细胞数大于95%，以0.2 mL接种于小鼠右腋皮下。
1.2.2  给药方法  于造模后第2天各实验组开始用药。模型组：生理盐水0.2 mL颈后皮下注射，每天1次，连续14 d；甘草多糖组：甘草多糖250 mg/kg颈后皮下注射，每天1次，连续14 d；CTX组：注射用CTX按预实验结果10 mg/(kg·d)腹腔注射，每天1次，共7 d；甘草多糖加CTX组：甘草多糖250 mg/kg颈后皮下注射，每天1次，连续14 d，注射用CTX腹腔注射10 mg/(kg·d)，每天1次，共7 d。实验第15天处死各实验组小鼠。
1.2.3  观测指标及检测方法
1.2.3.1  甘草多糖对H22荷瘤小鼠脾脏指数的影响  乙醚麻醉取血后，脱颈处死小鼠。剥离脾脏，称取质量，计算脾脏指数。脾脏指数=脾脏质量/体质量×100%。
1.2.3.2  脾淋巴细胞转化率实验  取各组小鼠6只，无菌取出脾脏放入盛有少量PBS液的培养皿中，用5 mL注射器针芯研磨脾脏，移入离心管中，用吸管吹打数次，300目尼龙布过滤，260×g离心5 min收集细胞。2 mL红细胞裂解液裂解红细胞，用PBS洗3遍，计数，调整细胞浓度为2×106个/mL。96孔细胞培养板每孔取100 μL细胞悬液，加100 μL含10%新生牛血清及青、链霉素的RPMI 1640培养基，置培养箱中在饱和湿度、5% CO2、37 ℃条件下，培养48 h。加入MTT 10 μL/孔，避光培养4 h；离心（400×g，10 min），吸弃上清液，再加入DMSO溶液100 μL，于酶标仪上检测波长为570 nm时各孔的吸光度值。
1.2.3.3  脾Treg细胞的流式细胞仪检测  调整脾脏淋巴细胞浓度为1×107个/mL，在每个流式上样管中加入100 μL细胞悬液。标记抗小鼠PE-Cy5-CD4、PE-CD25抗体，避光4 ℃孵育30 min。用预冷的PBS洗涤细胞，旋涡震荡重悬细胞后加入1 mL的固定/破膜工作液并再次旋涡混匀，避光4 ℃孵育30 min。加入2 mL破膜缓冲工作液离心洗涤细胞并弃去上清液，直接加入稀释好的荧光标记Foxp3抗体5 μL，避光4 ℃孵育30 min，加入4 mL破膜缓冲工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。0.5 mL PBS重悬细胞，上机检测CD4+CD25+ Foxp3+T细胞亚群并分析CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T细胞比值。具体方法为在前向角-侧向角光散射点图上选定淋巴细胞亚群，然后分析该群细胞中CD4+T细胞内Foxp3表达情况。以CD4/侧向角光散射设门，选择CD4+细胞分析CD25和Foxp3表达，并按CD25表达程度的不同设门分析其中Foxp3+细胞所占比例。
1.3  统计学方法  实验数据以`x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析。采用两因素析因设计方差分析进行多组间比较，组间两两比较采用t检验。

2  结果
2.1  甘草多糖对荷瘤鼠脾脏指数的影响  模型组脾脏指数明显高于正常组，甘草多糖组脾脏指数较CTX组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。各治疗组组间比较，CTX组脾脏指数降低（F=0.581，P=0.452），甘草多糖组脾脏指数升高（F=10.9，P<0.01），甘草多糖和CTX联合应用对脾脏指数的影响无交互作用（F=0.356，P=0.555）。两药物联合应用组脾脏指数较CTX组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1  甘草多糖对荷瘤鼠脾脏指数的影响
Figure 1  Effects of Radix Glycyrrhizae polysaccharide on spleen index of tumor bearing mice

^*P<0.05, ^**P<0.01, vs normal group; ^▲P<0.05, vs CTX group. Data were represented as `x±s, n=6.

2.2  甘草多糖对脾淋巴细胞转化率的影响  模型组的脾淋巴细胞转化率明显低于正常组(P<0.05)，甘草多糖组的脾淋巴细胞转化率明显高于模型组。各治疗组组间比较，CTX组脾淋巴细胞转化率降低（F=2.77，P=0.117），甘草多糖组脾淋巴细胞转化率升高（F=14.9，P<0.01），甘草多糖和CTX联合应用对脾淋巴细胞转化率的影响无交互作用（F=0.008，P=0.93）。两药物联合应用组脾淋巴细胞转化率较CTX组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2  甘草多糖对脾淋巴细胞转化率的影响
Figure 2  Effects of Radix Glycyrrhizae polysaccharide on spleen lymphocyte transformation ratio

*P<0.05, ^**P<0.01, vs normal group; ^△P<0.05, vs untreated group; ^▲P<0.05, ^▲▲P<0.01, vs CTX group. Data were represented as `x±s, n=6.

2.3  甘草多糖对脾CD4+CD25+Foxp3+/CD4+ T细胞比值的影响  模型组Treg水平明显升高，与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；甘草多糖及甘草多糖加CTX组Treg水平较模型组降低，差异有统计学意义，但Treg仍未达到正常水平，与正常组比较，差异有统计学意义。各治疗组组间比较，CTX组Treg水平降低（F=23.09，P<0.01），甘草多糖组Treg水平降低（F=139.85，P<0.01），甘草多糖和CTX联合应用对Treg水平的影响无交互作用（F=0.463，P=0.504）。两药物联合应用组Treg水平较模型组显著升高（P＜0.01）。见图3。
    

图3  甘草多糖对脾CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T细胞比值的影响
Figure 3  Effects of Radix Glycyrrhizae polysaccharide on ratio of CD4+CD25+Foxp3+ and CD4+ T cells

^*P<0.05, ^**P<0.01, vs normal group; ^△△P<0.01, vs untreated group; ^▲▲P<0.01, vs CTX group. Data were represented as `x±s, n=6.

  3  讨论
      机体的免疫功能和免疫状态与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。脾脏是最大的淋巴器官，也是重要的外周免疫器官之一，含有大量的T细胞、自然杀伤细胞及淋巴因子激活的杀伤细胞等。另外，脾脏也是对血源性抗原产生免疫应答的场所，可合成并分泌补体、干扰素等生物活性物质，脾脏指数间接反映了机体的免疫状况^［5］。
      本研究发现，甘草多糖组及甘草多糖加CTX组脾脏指数高于正常组，推测甘草多糖作为外来性抗原，直接刺激脾脏淋巴细胞发生增殖，并且这也与本研究中脾淋巴细胞转化实验结果相符。
      CTX是常用的化疗药之一，广泛应用于多种癌症的治疗^［6，7］。而化疗药物多属于细胞毒性药物，对肿瘤细胞和正常细胞无选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时，破坏或阻止增殖旺盛的骨髓造血细胞DNA合成，从而引起骨髓抑制^［8］，影响免疫系统。为进一步探究甘草多糖的免疫调节作用，我们做了脾淋巴细胞转化实验。研究表明，甘草多糖组小鼠的淋巴细胞转化率明显高于CTX组，甘草多糖加CTX组脾淋巴细胞转化率与CTX组相比有增高趋势。推测甘草多糖作用机制是通过促进T淋巴细胞增殖发挥免疫调节作用，这也与我们所做的相关细胞学实验结果相符（数据未发表）。
      Treg细胞概念的提出由来已久，但是由于未能发现该类细胞的特异性分子标志，Treg细胞的存在曾一度受到质疑。直到Foxp3基因功能的发现，近年来才明确Treg细胞指的是一群CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺的T细胞亚群^［9］。国内外对这类调节性T细胞的研究已从自身免疫耐受、移植免疫逐渐扩展到肿瘤免疫，认为Treg是形成肿瘤免疫耐受的关键成分。为进一步研究甘草多糖对Treg的免疫调节作用，我们对各用药组CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞进行了检测。研究结果发现，与正常组比较，模型组小鼠外周脾脏Treg细胞水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。经干预后发现，甘草多糖组和甘草多糖加CTX组Treg细胞水平明显低于模型组，差异具有统计学意义。CTX组Treg水平降低，与近期研究单次小剂量CTX在数量上及功能上都具有抑制调节性T细胞的作用^［10-13］结果一致。实验结果提示，荷瘤小鼠Treg细胞比例增高，由此导致直接抑制效应性T细胞的抗肿瘤免疫，从而使肿瘤细胞更容易逃逸杀伤细胞的攻击，同时上调的Treg细胞分泌各种免疫抑制因子，如白细胞介素10、转化生长因子β等发挥介导免疫抑制的功能，最终使肿瘤细胞能够逃逸免疫监视系统。
      本研究显示，甘草多糖可降低荷瘤小鼠Treg细胞的比例并提高脾脏指数、脾淋巴细胞转化率，推测其可能在调节免疫功能紊乱和治疗肿瘤免疫性疾病时存在作用靶点。抑制Treg细胞的免疫抑制功能也许是其作用机制之一，其更深入的作用机制有待于进一步研究。