Rev Chilena Infectol 2012; 29 (4): 401-405

ARTÍCULO ORIGINAL
MICROBIOLOGÍA

 

Aislamiento ambiental de Sporothrix globosa en relación a un caso de esporotricosis linfo-cutánea

Sporothrix globosa isolation related to a case of lymphocutaneous sporotrichosis

 

Rodrigo Cruz, Peggy Vieille y David Oschilewski

Universidad de Valparaíso. Laboratorio de Micología (RC).
Universidad de Valparaíso. Laboratorio de Micología y Anatomía Patológica (PV).
Universidad de Valparaíso. Cátedra de Dermatología (DO).

Correspondencia a:

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Introduction: Sporothrix schenckii complex comprises a group of environmental dimorphic fungi that cause sporotrichosis. In Chile, isolated cases have been reported in humans, though no environmental isolates have been described. Objective: To achieve isolation of Sporothrix complex from the soil where a 75 year old patient with lymphocutaneous sporotrichosis performs horticulture work. Materials and Methods: In March and July 2011 soil and plant debris from five sectors where the patient does his work in horticulture was extracted. The soil samples were diluted and inoculated in Sabouraud agar with cycloheximide and chloramphenicol at 26 °C. The plant debris was directly inoculated in the same medium. Colonies suggestive of Sporothrix complex were reseeded in PDA agar at 26 ° C and identified as recommended by Marimon et al. Results: Of the 10 plates from the first sampling, one colony was identified as Sporothrix globosa. In the second sampling, Sporothrix globosa grew in two plates seeded with soil, with a total of 6 colonies. There was no growth of Sporothrix complex in plant debris. The isolate from the patient was also identified as Sporothrix globosa. Conclusion: For the first time in Chile a species of Sporothrix complex was isolated from the environment. Sporothrix globosa was the species identified both in the ground and from the patient with sporotrichosis.

Key words: Sporotrichosis, Sporothrix globosa, environment.

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Resumen

Introducción: Sporothrix schenckii complex comprende un grupo de hongos dimórficos ambientales que provocan esporotricosis. En Chile se han comunicado casos aislados en humanos; sin embargo, no se han descrito aislamientos de este hongo desde el ambiente. Objetivos: Orientados por un caso de esporotricosis linfo-cutánea en una paciente de 75 años, se realizó un estudio ambiental para lograr el aislamiento de S. complex desde el suelo donde la paciente realizaba labores de horticultura. Materiales y Métodos: Se extrajo tierra y restos vegetales de cinco sectores donde la paciente efectuaba sus labores de horticultura. Se realizaron diluciones de tierras y siembra en agar Sabouraud con cicloheximida y cloranfenicol a 26°C. Los restos vegetales fueron sembrados directamente en el mismo medio. Las colonias sugerentes de S. complex se resembraron en agar PDA a 26°C y se identificaron según recomendación de Marimon y cols. Resultados: De las diez placas del primer muestreo, una colonia de la siembra de tierra se identificó como Sporothrix globosa. En el segundo muestreo hubo desarrollo de S. globosa en dos placas sembradas con tierra, con un total de seis colonias. No hubo desarrollo de S. complex en los restos vegetales. La cepa aislada desde la paciente también fue identificada como S. globosa. Conclusión: Por primera vez en Chile se logra el aislamiento del ambiente de una especie de S. complex. Sporothrix globosa fue la especie identificada tanto del suelo como desde la paciente con esporotricosis.

Palabras clave: Esporotricosis, Sporothrix globosa, ambiente.

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Introducción

porothrix schenckii complex comprende un grupo de hongos dimórficos, ampliamente distribuidos en la naturaleza, especialmente en la tierra, restos vegetales y plantas^1,2. Su estado sexual aún no ha sido descrito; sin embargo, se relaciona estrechamente con Ophiostoma stenocerans^{3 4}. Son los agentes causales de la esporotricosis, un tipo de micosis subaguda o crónica frecuente en América Latina, principalmente en lugares donde existe un clima tropical o subtropical, con suelos de alto contenido orgánico, temperaturas cercanas a 25°C y una humedad relativa sobre 90%⁵. Las formas clínicas de esta infección son variables, siendo más común la presentación linfo-cutánea de extremidades, seguida de la forma fija o cutánea localizada y en menor porcentaje, las formas diseminadas y extra-cutáneas^6,7. Afecta principalmente a granjeros, jardineros, agricultores, veterinarios o a aquellas personas que están en contacto con sustratos orgánicos y que presentan algún trauma cutáneo, por ejemplo, con espinas de rosas u otras plantas^2,5,7.

Trabajos moleculares y fenotípicos recientes demuestran que S. schenckii corresponde a un complejo de especies (Sporothrix complex), en el cual se encuentran tres de importancia médica (S. schenckii sensu stricto, S. brasiliensis y S. globosa), además de S. mexicana y S. albicans, aisladas sólo del ambiente hasta el momento^8-11. Las tres primeras especies pueden presentar virulencia y formas clínicas diferentes¹².

En América, se han comunicado casos desde E.U.A hasta Argentina; con mayor frecuencia en México, Guatemala, El Salvador, Costa Rica, Venezuela, Colombia, Brasil y Uruguay^7-13. En Chile, se han presentado casos aislados de esporotricosis humana^14,15; sin embargo, hasta la fecha no se ha comunicado aislamiento alguno de este hongo desde el ambiente. Piontelli y cols., sugieren la presencia de S. complex (sin poder obtenerse la cepa pura por estar mezclada con O. stenocerans) en especies de Eucalyptus y asociada a un coleóptero (Ectinogonia buquetti Spin)³.

Presentamos un caso de esporotricosis linfo-cutánea autóctono, en una paciente de 75 años, residente en el sector de Las Dichas (Valparaíso), quien había sufrido un traumatismo con una espina de rosa en el dedo índice derecho (Figura 1). El diagnóstico se realizó mediante microscopia directa y cultivos de las lesiones de mano y antebrazo derechos. La paciente fue tratada con itra-conazol vo, 200 mg al día, durante 4 meses, con buena respuesta clínica, por lo que actualmente se encuentra asintomática y realizando nuevamente sus actividades en el campo.

Figura 1. Lesiones granulomatosas linfo-cutáneas que nacen desde el dedo índice hasta el antebrazo derecho..

Motivados por este caso, efectuamos un estudio ambiental en el terreno donde la paciente realizaba a diario sus actividades de horticultura, con el objetivo de lograr el aislamiento e identificación de especies de S. complex, y de ser así, comparar estas cepas con aquella aislada desde la paciente.

Materiales y Métodos

El terreno donde se tomaron las muestras ambientales pertenece a Las Dichas, localidad de aproximadamente 500 habitantes, ubicado en el espesor de la cordillera de la costa de la Región de Valparaíso, en el camino de Casablanca a Algarrobo. Es una zona rural donde abundan los animales de corral y las huertas familiares¹⁶. Se identificaron cinco sectores donde la paciente desarrollaba usualmente labores de horticultura y donde pudo haber sufrido la inoculación del agente. Durante dos meses se tomaron veinte muestras (diez por mes) de suelo y de restos vegetales de los sectores identificados como:

    Área 1: rosal
    Área 2: sauc
    Área 3: chacra
    Área 4: gallinero
    Área 5: contigua al gallinero y la chacra

Para el análisis de suelo, se emplearon tubos cónicos estériles Miniplast® de 15 ml, los cuales fueron numerados según la identificación anterior. Cada uno fue adicionado con 2,5 g de tierra correspondiente más 12,5 ml de agua estéril. Los tubos fueron agitados en vortex por 2 min y dejados en reposo por 20 min. Luego se extrajo de c/v 0,5 ml de sobrenadante por tubo para ser sembrado en placas Petri con agar Sabouraud con cicloheximida (400 μg/L) más cloranfenicol (125 μg/L) e incubadas a 26°C. El crecimiento en cada placa fue controlado bajo lupa estereoscópica cada 48 h.

Los restos vegetales fueron depositados directamente, sin tratamiento previo, sobre la superficie de una placa con los mismos medios antes señalados. Igual que con las muestras de tierra, las placas se incubaron a 26°C y fueron revisadas cada 48 h. De las colonias sugerentes de S. complex, se realizaron resiembras en agar papa dextrosa (PDA) a 26°C hasta obtener colonias libres de otros hongos y/o bacterias contaminantes.

En la identificación de las especies de Sporothrix se consideró la clave morfo-fisiológica propuesta por Marimon y cols.¹⁰ (Tabla 1). Las colonias fueron caracterizadas según color, textura, crecimiento y producción de pigmentos. El estudio fisiológico fue realizado en agar PDA a 30, 35 y 37°C por 21 días. La asimilación de carbohidratos (sucrosa y rafinosa) se realizó en una base nitrogenada¹⁷. El estudio microscópico consideró el diámetro de las hifas y conidióforos y la forma, tamaño, coloración y disposición de los conidios.

Resultados

De las diez placas evaluadas en la primera serie de muestras, se obtuvo una colonia del área 5 de la siembra de tierra, de color crema, que posteriormente se tornó oscura y formó abundante micelio. Parte de esta colonia se sembró en caldo cerebro-corazón a 35°C, lográndose la conversión a su estado levaduriforme (formas redondas, ovales y algunas alargadas con forma de "cigarro").

En la segunda serie de muestras, de las diez placas estudiadas, hubo desarrollo de la misma especie en una placa del área 5 y en una del área 4 (ambas siembras de tierra), con un total de seis colonias. No hubo desarrollo de colonias compatibles con S. complex en los restos vegetales sembrados de los dos muestreos.

Estudio morfo-fisiológico de las colonias: Incubadas en PDA a 30°C por 21 días las colonias tuvieron un crecimiento de hasta 35 mm de diámetro, con color crema hasta la segunda semana, luego adquirieron un color oscuro (Figura 2). A 35°C hubo desarrollo de hasta 6 mm de diámetro y a 37°C no hubo desarrollo de hongos. En las pruebas de asimilación de azúcares hubo positividad para sucrosa, pero no para rafinosa.

Figura 2. Colonia oscura de 21 días de desarrollo en PDA. La marca corresponde a 1 cm.

Estudio microscópico: Durante la primera semana se observaron hifas delgadas, hialinas, septadas y ramificadas con abundantes conidios hialinos, en cúmulos en la región terminal del conidióforo, de tipo simpodial, en su mayoría globosos a subglobosos, con 2 a 5 μπι de largo por 1 a 3 μm de ancho (Figura 3). Transcurrida la segunda semana de incubación, se observó desarrollo de conidios pigmentados secundarios (raduloconidios), predominantemente globosos a subglobosos, con 2,5 a 4 μm de largo y 2 a 3,5 μm de ancho (Figura 4).

		Figura 3. Micelio fino con conidios hialinos subglobosos simpodiales a los 10 días de cultivo. Microscopía DIC 100X.
		Figura 4. Conidios sésiles café oscuros (raduloconidios) a los 15 días de cultivo. Microscopia DIC 100X.

Todos estos resultados fueron compatibles con S. globosa según la clave morfofisiológica propuesta por Marimon y cols.¹⁰ (Tabla 1).

La cepa aislada de la paciente presentó total coincidencia morfo-fisiológica y microscópica con las cepas aisladas desde la tierra de las áreas señaladas, por lo que también fue identificada como S. globosa.

Discusión

En Chile, la esporotricosis es una enfermedad poco frecuente, con algunos reportes de presentación linfo-cutánea, principalmente en extremidades^14,15. El caso que originó este estudio ambiental se presentó en una paciente con antecedente de un trauma por espina de rosa en labores de horticultura, situación que coincide con los casos publicados en la literatura científica nacional e internacional^{6,14,15,18,19}.

Las condiciones geográficas y climáticas del sector de Las Dichas en Valparaíso corresponden a un clima templado-cálido, con lluvias invernales, una estación seca prolongada (7 a 8 meses), gran nubosidad y una humedad atmosférica promedio de 82%²⁰, las que no serían favorables para el desarrollo del hongo; no obstante, hubo desarrollo de Sporothrix en las dos muestras tomadas, con mayor número de colonias en invierno, donde las temperaturas en la zona estudiada bajan considerablemente.

Estudios moleculares han demostrado la existencia de varias especies patógenas relacionadas con S. schenckii; tales como S. brasiliensis y S. mexicana, las que se encuentran exclusivamente en Brasil y México, respectivamente. En cambio, S. schenckii y S. globosa tienen una distribución trans-oceánica²¹. Se ha aislado S. globosa en el Reino Unido, España, Italia, China, Japón, India, México y en el centro-sur de los E.U.A.⁹. Los aislamientos de S. globosa realizados en este estudio son los primeros en nuestro país, lo que tiene una importancia no solamente epidemiológica, sino también de patogenicidad, ya que S. schenckii y S. brasiliensis pueden provocar lesiones cutáneas y diseminadas; en cambio, S. globosa no provocaría infección cutánea diseminada o compromiso extracutáneo, ya que a pesar de presentar conidios secundarios, no logra un adecuado desarrollo a 37°C¹².

Los conidios oscuros, por producción de melanina, le dan las características más importantes a las colonias y son las estructuras infectantes que presentan menor susceptibilidad a la luz UV, a la ionización y a la acción de radicales libres, además de presentar mayor resistencia a la fagocitosis. Los compuestos melanoides se ponen de manifiesto en medios de cultivo como PDA y alpiste negro, tal como las cepas obtenidas en nuestro estudio, considerándose como un factor propio de cepas patógenas que pueden llegar a originar esporotricosis^22,23.

Marimon y cols.¹⁰ proponen una clave morfo-fisiológica para diferenciar las especies clínicamente relevantes de S. complex, basada en la pigmentación de los conidios, crecimiento en PDA a diferentes temperaturas y asimilación de azúcares. Este método tiene la ventaja de ser de bajo costo y, por lo tanto, posible de realizar en la mayoría de los laboratorios de micología. Sin embargo, la secuenciación del gen de la calmodulina es una herramienta útil en investigación, con una alta especificidad en la identificación de las especies del complejo, ya que pueden existir variaciones morfológicas que pueden llevar a errores taxonómicos^10,24.

Creemos que es necesario aumentar la sospecha clínica de esporotricosis en nuestro medio, además de realizar otros estudios ambientales con el fin de determinar la extensión y colonización de este agente en otros lugares y sustratos. Por otra parte, será fundamental implementar a corto plazo la identificación molecular de las distintas especies de S. complex y así complementar los estudios morfo-fisiológicos que comienzan a realizarse en nuestro país y Latinoamérica.

Agradecimientos: A Eduardo Piontelli del Laboratorio de Micología de la Universidad de Valparaíso por su ayuda en la identificación de las especies y a Jenny Llanos del laboratorio de Microbiología de la Universidad de Valparaíso por las correcciones del texto y a Genoveva Choappa por sus infinitas enseñanzas y alegrías.

 

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Los autores declaran no tener conflictos de interés.

Financiado con fondos propios del laboratorio, Universidad de Valparaíso.

Recibido: 12 de noviembre de 2011 Aceptado: 26 de mayo de 2012

Correspondencia a:Rodrigo Cruz Choappa rcruzchoappa@gmail.com