Distribuição da sacarose-fosfato sintase e sacarose sintase em bananas durante o amadurecimento¹

 

Priscila Z. BASSINELLO^2,*, Ana Paula FIORAVANTE², João R. O. do NASCIMENTO², Beatriz R. CORDENUNSI², Franco M. LAJOLO²

 

 

---

RESUMO

A hidrólise do amido e a síntese de açúcares durante o amadurecimento da banana são transformações bioquímicas importantes, havendo evidências de que ocorrem de forma homogênea no fruto. Para confirmar este fato, amostras de banana nanicão (Musa spp.) colhidas aos 110 dias pós-antese, foram coletadas no decorrer do amadurecimento e foram determinados os teores de amido, hexoses e sacarose e a atividade das enzimas sacarose-fosfato sintase (SPS) e sacarose sintase (SS) em diferentes partes do fruto. Observou-se que na banana verde, existe mais amido na porção periférica (18%) do que na central (13%). Porém, a sua velocidade de degradação durante o amadurecimento é a mesma, o que resulta em teores diferenciados de amido residual na banana madura. Também o aparecimento e acúmulo de sacarose foi simultâneo nas duas regiões e coincidente com os valores máximos de atividade da SPS. Utilizando-se de técnica de identificação por anticorpos específicos para SS e SPS em tecidos verde e maduro, observou-se uma distribuição homogênea das enzimas e aparente correlação entre a cor desenvolvida e a variação de atividade.

Palavras-chave: banana, amadurecimento, carboidratos, enzimas.

---

SUMMARY

SUCROSE PHOSPHATE SYNTHASE AND SUCROSE SYNTHASE ENZYMES DISTRIBUTION DURING BANANA FRUITS RIPENING. The starch breakdown and synthesis of sugars are important biochemical transformations during banana fruit ripening and seem to happen in an homogeneous way in the fruit. To confirm this fact, samples of banana cv. nanicão (Musa spp.) harvested with 110 days after anthesis were collected during ripening and amounts of starch, hexoses and sucrose, and the activity of the enzymes sucrose phosphate synthase (SPS) and sucrose synthase (SS) were estimated. It could be observed that there is a bigger concentration of starch in the peripheric portion of green banana (18%) than in the central part (13%). However, the speed of starch degradation during maturation is the same, which results in different concentrations of residual starch in the ripe banana. In addition, the sucrose appearing and accumula-tion happened at the same time in both regions and coincided with the maximum values of SPS activity. Using the "Tissue Print" technic, it was possible to observe that SPS and SS are uniformily distributted in the hole pulp of both green and ripe tissues, and that there is an apparent correlation between the developed color and the activity variation.

Keywords: banana, ripening, carbohydrates, enzymes.

---

 

 

1 – INTRODUÇÃO

Frutos como a banana tornam-se doces após a colheita como resultado da degradação do amido acumulado durante a sua formação, com conseqüente conversão em açúcares solúveis. O sistema enzimático envolvido na degradação do amido e formação da sacarose em frutos é complexo e pouco conhecido. A hidrólise do amido na banana pode envolver amilases e glicosidases produzindo dextrinas de alto e baixo peso molecular (GARCIA, LAJOLO [9]), e ter a participação das fosforilases produzindo glicose-1-P (ARÊAS, LAJOLO [1]). Quanto à produção de açúcares, existem fortes evidên-cias de que a síntese da sacarose é catalisada pela enzima sacarose-fosfato sintase (SPS) (Hubbard, HUBER, PHARR [12]; Cordenunsi [7]). A sacarose sintase (SS), enzima que pode atuar reversivelmente tanto na síntese como na hidrólise da sacarose, tem atividade alta enquanto o fruto está em formação. Provavelmente participa da síntese de amido e de polissacarídeos da parede celular, hidrolisando a sacarose formada via fotossíntese e permitindo a formação de açúcares-nucleotídeos como a ADP-glicose e UDP-glicose. Quando o fruto é colhido (cerca de 110 dias pós-antese), sua atividade já está decaindo, chegando a níveis muito baixos quando o fruto está maduro (Cordenunsi, Lajolo, [8]).

LOESECKE [13] observou que a banana começa a amadurecer simultaneamente com a degradação do amido, a partir das extremidades do fruto e progredindo em direção ao meio. GARCIA e LAJOLO [9] determinaram o teor de amido e a relação amilose/amilopectina do tecido, estudando seu desaparecimento in situ e verificaram que o amido começa a ser degradado ao mesmo tempo nas extremidades e região intermediária, e o seu desaparecimento gradual ocorreria de forma radial, do centro para a periferia do fruto.

Neste trabalho, procuramos confirmar se o amadurecimento da banana é iniciado no centro do fruto irradiando-se para a periferia, através da determinação dos teores de amido e sacarose. Procuramos também localizar, através do uso de anticorpos específicos anti-enzimas, a distribuição da SPS e SS e avaliar suas atividades.

 

2 – MATERIAL E MÉTODOS

Frutos do cultivar Nanicão, com aproximadamente 110 dias pós-antese (ponto de colheita comercial) e 1 dia após a colheita, foram obtidos no CEAGESP. As pencas foram lavadas em solução de hipoclorito de sódio a 5% e armazenadas em câmara incubadora a 19ºC ± 3ºC e 75% UR ± 5% até completar o amadurecimento, sendo amostradas no decorrer deste tempo. As bananas foram cortadas transversalmente na região intermediária em fatias de aproximadamente 3mm de espessura. Com o auxílio de um furador de rolha com 9 mm de diâmetro foram retiradas as porções centrais de cada fatia e o restante foi considerado porção periférica. As amostras foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80ºC.

Os teores de amido e de açúcares das amostras foram determinados enzimaticamente, sendo o amido solubilizado com hidróxido de sódio 0,5 N, precipitado com etanol 80%, hidrolisado com amiloglicosidase e a glicose liberada determinada pelo sistema glicose oxidase/peroxidase/ABTS, segundo BERGMEYER [4]. Os açúcares solúveis (glicose, frutose e sacarose) foram determinados na fração solúvel da extração do amido pelo sistema hexoquinase/glicose-6P desidrogenase/fosfoglicose isomerase, medindo-se a produção de NADPH a 340nm (BERGMEYER [4]; ARÊAS, LAJOLO [1]). A proteína foi estimada por BRADFORD [6].

A extração das enzimas foi feita homogeneizando-se uma parte do fruto pulverizado em nitrogênio líquido, com 8 partes de solução extratora (Tris -HCl 100 mM pH 8,0; EDTA 10 mM, cisteína 20 mM recentemente neutralizada e 1% de polivinilpirrolidona 40.000), em homogeneizador TURRAX por 30 segundos (TERRA, LAJOLO [17]; CORDENUNSI [7]). O homogenato foi centrifugado a 7600 xg por 5 minutos e o sobrenadante dialisado por 16 horas contra tampão de diálise Tris-HCl 20 mM pH 7,0 contendo EDTA 4 mM e Cisteína 5 mM recentemente neutralizada.

A atividade da SPS foi determinada por incubação a 37^oC em meio saturante composto de 20ml do extrato enzimático e 30ml de tampão Hepes-KOH 50 mM pH 7,5 contendo NaF 1 mM, frutose-6P 5 mM, glicose-6P 15 mM, UDPG 10mM, MgCl₂15 mM. O meio saturante para determinação da atividade da SS consistiu em 25 mL do extrato enzimático e 25mL de tampão Tris-HCl 100 mM pH 7,6 contendo NaF 1 mM, frutose 10 mM, UDPG 5 mM e MgCl₂ 15 mM e as incubações feitas à mesma temperatura da SPS. A reação foi interrompida com adição de 200 ml de NaOH 1,0 N, sendo a frutose remanescente destruída por 10 minutos de fervura e a sacarose determinada pelo método do ácido tiobarbitúrico (PERCHERON [16]).

Para o Tissue Print Western-blot, secções transversais e longitudinais (de aproximadamente 1mm de espessura) da banana (verde e madura), feitas manualmente com bisturi, foram pressionadas sobre membranas de nitrocelulose e nylon. Após transferência, as membranas foram bloqueadas por incubação por 1 hora em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5; NaCl 150 mM (TBS) contendo leite desnatado a 5%. Posteriormente, foi adicionado o anti-soro de coelho contra SPS (NASCIMENTO [15]) ou SS (BENDAZZOLI et al. [3]) perfazendo uma diluição de 1:1000. Após incubação sob agitação por 2 horas à temperatura ambiente, as membranas foram lavadas 3 vezes por 20 minutos em tampão TBS e incubadas por 2 horas com anticorpo de cabra anticoelho, conjugado com fosfatase alcalina, em TBS (leite 5%). O desenvolvimento de cor foi obtido por incubação das membranas em tampão para fosfatase alcalina (Tris-HCl pH 9,5; NaCl 100mM; MgCl₂ 5mM) contendo nitrobluetetrazólio (NBT; 150 mg/mL) e 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP; 75 mg/mL).

 

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 – Teores de amido e açúcares no centro e periferia da banana durante o amadurecimento

Os teores iniciais de amido do centro e da periferia da banana são diferentes. Enquanto a periferia tem por volta de 18% de amido, o centro tem ao redor de 13% (Figura 1). Em ambos, a degradação do amido começa aos 12 dias após a colheita (dpc) sendo que aos 22 dpc, quando a banana está completamente madura, o amido residual da periferia (1,41%) é maior que no centro (0,55%). A razão teor inicial de amido /teor residual de amido é de 12,72 vezes para a periferia da banana e de 23,42 vezes para o centro, indicando que os processos de degradação do amido são mais marcantes no centro da banana. Garcia e Lajolo [9], em estudos de coloração com iodo in situ em cortes de banana, afirmaram que o início do amadurecimento do fruto se dava a partir do centro do fruto, irradiando-se para as regiões periféricas ao longo do amadurecimento, devido à degradação do amido por hidrolases. Os dados aqui obtidos sugerem que o processo de degradação se inicia em todo o fruto simultaneamente. Os menores teores de amido na região central torna-riam mais evidente a sua degradação, o que pode ter sido interpretado erroneamente como iniciação do processo a partir das regiões mais internas do fruto. Apesar do início simultâneo, as duas regiões apresentam teores residuais de amido distintos, que podem indicar diferenças quanto à composição desse polissacarídeo e sua suscetibilidade à ação de hidrolases. Na periferia, o amido residual correspondeu a 7,86% do amido total, enquanto no centro esse valor correspondeu a 4,2% do amido inicialmente disponível.

 

 

Pode-se observar também que os teores de sacarose aumentaram rapidamente aos 19dpc, com seus valores máximos aos 21dpc, tanto na região periférica quanto central. O teor de sacarose na periferia (12,73%) foi maior do que o observado no centro (10%), porém, se considerarmos o percentual do amido hidrolisado que foi convertido em sacarose, iremos obter valores muito próximos, 77% e 79%, para a periferia e centro respectivamente, mostrando que nas duas regiões o processo de conversão amido-sacarose se deu com a mesma eficiência.

Os teores de hexoses na periferia e no centro variaram entre 1,5% e 3% aproximadamente, porém, essas regiões diferiram quanto à relação glicose/frutose. Enquanto no centro do fruto essa relação foi constante de 1:1, na periferia houve uma diminuição com o progresso do amadurecimento, com valores de glicose sendo reduzidos a cerca de 70% daqueles observados para a frutose aos 21dpc. Esse desequilíbrio em favor da frutose pode ser causado por maior mobilização de glicose para a respiração nos tecidos periféricos ou outros processos metabólicos do fruto (BIALE [5]; BEAUDRY et al. [2]; HILL, REES [10; 11]).

3.2 – Atividade da SPS e da SS durante o amadurecimento da banana

Por trabalhos anteriores sabe-se que existe estreita correlação entre acúmulo de sacarose e aumento de atividade da SPS para todos os cultivares de banana já estudados (Nascimento [15]; Mota [14]). Neste trabalho, observamos que a atividade máxima da SPS ocorre aos 21 dpc, coincidindo com o teor máximo de sacarose. A atividade foi de aproximadamente 55 U na região periférica e 73 U na região central (Figura 2). Considerando os valores de sacarose nessas regiões (12% na periferia e 10% no centro) observamos que valores de atividade da SPS mais elevados não se refletiram em maiores teores de açúcares, confirmando os resultados de MOTA [14] e NASCIMENTO [15], de que o fator limitante parece ser a disponibilidade de substrato para a síntese de sacarose e não dos teores de enzima. Apesar das diferenças entre as atividades máximas, a quantidade de enzima parece ser suficiente para a síntese de sacarose em ambas as regiões, uma vez que a eficiência de conversão do amido mobilizado foi aproximadamente igual (77% e 79%)

 

 

Em frutos não-tratados com etileno exógeno, a degradação do amido durante o climatério inicia-se por volta de 12 dias pós-colheita (122 dpa). Neste estudo, confirmamos os dados obtidos por Cordenunsi [7] e Bendazzoli et al. [3], quanto à não correlação entre síntese de sacarose e atividade da SS. Aos 110 dpa (1 dpc), quando a banana estava fisiologicamente madura, o acúmulo de amido já havia praticamente chegado ao fim e a atividade da SS começava a diminuir, sendo os valores iniciais de atividade maiores na periferia do que no centro da fatia (Figura 2). Apesar de não se conhecer o papel exato da SS no processo de síntese de amido e parede celular durante o desenvolvimento do fruto, é possível que as diferenças de atividade observadas no centro e na periferia estejam relacionadas às diferenças nos teores de amido dessas regiões.

3.3 – Distribuição da SS e SPS

A técnica empregada para visualizar a distribuição da SPS e SS consistiu em imprimir uma secção do tecido da banana em membrana de nitrocelulose ou nylon, de modo que o conteúdo celular fosse transferido, e submeter as membranas ao procedimento usual de Western blot. Foi uma maneira rápida e simples de avaliar a distribuição das enzimas na polpa da banana.

As membranas analisadas com anticorpos anti-SPS ou anti-SS (Figura 3), confirmaram que a distribuição das enzimas é homogênea por toda a polpa. Parece não haver diferença significativa na cor desenvolvida nas porções do fruto estudadas (centro e periferia), assim como para o tipo de membrana utilizada. Entretanto, é possível observar um certo aumento na intensidade da cor do corte verde para o maduro, quando hibridizado com anticorpos anti-SPS, sugerindo um aumento da expressão da enzima, enquanto o inverso ocorre com a SS.

 

 

Uma vez que não há controle sobre a quantidade de conteúdo do tecido que é transferida, é difícil afirmar, com base na intensidade da cor, se há aumento ou diminuição na quantidade de determinada enzima. Porém, esses resultados estão de acordo com o observado por NASCIMENTO [15] para a SPS. No caso da SS, a diminuição na intensidade da cor encontra relação com a diminuição da atividade, contudo, é necessário confirmar se essa queda decorre de diminuição na expressão ou de regulação alostérica.

 

4 – CONCLUSÕES

Pelos resultados deste trabalho, pode-se concluir que as regiões periférica e central do fruto da bananeira possuem diferentes teores relativos de amido e açúcares, e que o amadurecimento tem início ao mesmo tempo em ambas as porções estudadas, sem distinção, contrariando resultados anteriores. A região periférica apresentou maiores teores de amido, que se refletiram em maiores teores de sacarose, porém, apresentou também maior quantidade de amido residual. Considerando-se apenas os valores de sacarose e de amido efetivamente utilizado, podemos concluir que a eficiência de conversão foi aproximadamente a mesma nas duas regiões. Foram observadas também diferenças quanto à relação glicose/frutose, que podem ser reflexo de maior consumo de glicose pela respiração, no tecido periférico.

As atividades das enzimas também diferiram quanto aos valores máximos na periferia e no centro, porém, variaram simultaneamente nas duas regiões. A atividade da SPS aumentou com o amadurecimento, correlacionando-se com o acúmulo de sacarose, mas atividades mais altas não se refletiram em maiores teores de açúcar. Aparentemente a quantidade de sacarose acumulada depende da quantidade de amido mobilizado, sendo que em ambas as regiões os níveis de atividade das enzimas foram adequados para a síntese.

A técnica empregada para a visualização macroscópica da distribuição das enzimas SPS e SS ("Tissue Print") mostrou-se satisfatória. Aparentemente essas enzimas se localizam de forma homogênea por toda a polpa, e as colorações desenvolvidas pelas membranas de tecido verde e maduro são coerentes com a variação de atividade da SS e da SPS durante o amadurecimento.

 

5 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] ARÊAS, J. A. G., LAJOLO, F. M. Starch transformation during banana ripening: I- The phosphorylase and phosphatase behavior in Musa acuminata . J. Food Biochem., Wesport, v. 5, p. 19-37, 1981.        [ Links ]

[2] BEAUDRY, R. M.; SEVERSON, R. F.; BLACK, C. C.; KAYS, S. J. Banana ripening: Implications of Changes in Glycolytic Intermediate Concentrations, Glycolytic and Gluconeogenic Carbon Flux, and Fructose 2,6-Biphosphate Concentration. Plant Physiology, Georgia, v. 91, p. 1436-1444, 1989.        [ Links ]

[3] BENDAZZOLI, W. S.et al. Purificação e caracterização parcial da sacarose sintase de banana (Musa cavendishii var. Nanicão). São Paulo, 1995. 60 p. (Dissertação de Mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo (USP).        [ Links ]

[4] BERGMEYER, H. U., ed Methods of enzimatic analysis. 2 ed. New York: Academic Press, v. 3, p. 1212-1215, 1974.        [ Links ]

[5] BIALE, J. B. Growth, Maturation, and Senescence in Fruits. Science, v. 146, n. 1, p.880-888, 1964.        [ Links ]

[6] BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72, p. 248-54, 1976.        [ Links ]

[7] CORDENUNSI, B. R. Síntese da sacarose no amadurecimento da banana: Envolvimento da sacarose sintase e sacarose fosfato sintase. São Paulo, 1989. 87 p. (Tese de Doutorado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo (USP).        [ Links ]

[8] CORDENUNSI, B.R.; LAJOLO, F.M. Starch transformation during banana ripening: sucrose synthase and sucrose phosphate synthase. J. Agric. Food Chem., Washington, v. 43, n. 2, p. 347-351, 1995.        [ Links ]

[9] GARCIA, E.; LAJOLO, F. M. Starch transformation during banana ripening : the amylase and glucosidase behavior. J. Food Sci., Chicago, v. 53, n. 4, p. 1181-1186, 1988.        [ Links ]

[10] HILL, S. A.; REES, T. ap. Fluxes of carbohydrate metabolism in ripening bananas. Planta, Cambridge, v. 192, p. 52-60, 1994.        [ Links ]

[11] HILL, S. A.; REES, T. ap. The effect of glucose on the control of carbohydrate metabolism in ripening bananas. Planta, Cambridge, v. 196, p. 335-343, 1995.        [ Links ]

[12] HUBBARD, N. L.; HUBER, S.C.; PHARR, D. M. Sucrose phosphate synthase and acid invertase as the determinants of sucrose concentration in developing Muskmelon (Cucumis melo L.) fruits. Plant Physiol.,v. 91, p. 1527-1534, 1989.        [ Links ]

[13] LOESECKE, H. W. VON. 1980. Banana: chemistry, physiology, technology. 2 ed. New York Interscience Publishers,. 189 p. (Economic Crops, 1).        [ Links ]

[14] MOTA, R. V. da. Metabolismo amido-sacarose e determinação dos açúcares solúveis em alguns cultivares de banana (Musa spp.). São Paulo, 1997. 75 p. (Dissertação de Mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo (USP).        [ Links ]

[15] NASCIMENTO, J. R. O. do. Purificação, caracterização parcial e expressão da sacarose fosfato sintase durante o amadurecimento da banana. São Paulo, 1997. 91 p. (Tese de Doutorado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo (USP).        [ Links ]

[16] PERCHERON, F. Dosage colorimétrique du fructose et des fructofuranosides par l’acide thiobarbiturique. C. R. Acad. Sci., Paris, v. 255, n. 19, p. 2521-2522, 1962.        [ Links ]

[17] TERRA, N. N.; GARCIA, E.; LAJOLO, F. M. Starch sugar transformation during banana ripening: the behavior of UDP-glucose pyrophosphorylase, sucrose synthase and invertase. J. Food Sci., v. 48, p. 1097-1100, 1983.        [ Links ]

 

6 – AGRADECIMENTOS

Agradecemos aos srs. Faco e Vicente da Comercial de Frutas Jaguaré (CEASA) pelo fornecimento dos frutos e à FAPESP pelo suporte financeiro.

 

 

¹Recebido para publicação em 05/07/98. Aceito para publicação em 06/04/99.

²Faculdade de Ciências Farmacêuticas/USP - Depto. de Alimentos e Nutrição Experimental. Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bloco 14, Cidade Universitária. CEP 05508-900. São Paulo, SP. E-mail: fmlajolo@usp.br

* A quem a correspondência deve ser enviada.