Adesão de linhagem selvagem de Streptococcus thermophilus em superfície de aço inoxidável e efeitos da higienização na sua remoção¹

 

Ana Lourdes Neves GÂNDARA^2,*, José Sátiro de OLIVEIRA²

 

 

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RESUMO

Linhagem selvagem de Streptococcus thermophilus isolada de leite pasteurizado foi avaliada em modelo experimental quanto a adesão em superfície de aço inoxidável e comportamento frente à limpeza e sanificação. Em leite, a adesão do microrganismo em aço inoxidável foi estudada em 6h de contato a 45°C sob agitação e uma higienização com detergentes alcalino e ácido seguida de sanificação foi utilizada para avaliação do comportamento das células aderidas frente à higienização. Esse microrganismo aderiu a essa superfície produzindo uma carga de 10⁴UFC/cm². Após a limpeza alcalina não foram detectadas células aderidas; em seguida a limpeza ácida 6 UFC/cm² ainda foram detectadas. A sanificação com hipoclorito de sódio, após a limpeza, foi suficiente para reduzir a carga de S. thermophilus selvagem aderida ao aço inoxidável. O modelo experimental mostrou-se adequado para o estudo, indicando que a cultura selvagem de Streptococcus thermophilus é produtora de biofilme em superfície de aço inoxidável. A limpeza da superfície de aço inoxidável por detergência alcalina remove mais que 99,9% das células aderidas. Pequenos números de células remanescentes são removidos na detergência ácida o que demonstra a necessidade das diferentes etapas e tipos de detergentes para a eficiência da limpeza. Melhores resultados na remoção desse biofilme são alcançadas com detergência alcalina seguida de detergência ácida e mais eficientemente quando se utiliza uma sanificação complementar com hipoclorito de sódio.

Palavras-chave: Streptococcus thermophilus; adesão; limpeza; sanificação; aço inoxidável.

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SUMMARY

Adhesion of a wild strain of Streptococcus thermophilus onto stainless steel surfaces and the effects of cleaning and sanification on its removal. A wild strain of Streptococcus thermophilus isolated from pasteurized milk was evaluated using an experimental model with respect to its adhesion onto stainless steel surfaces and its behaviour when submitted to cleansing and sanification. In milk, the adhesion of the microorganism on to stainless steel surfaces was studied after 6 hours of contact at 45°C with agitation, and after a cleansing process involving cleaning stages with alkaline and acid detergents followed by sanification, in order to evaluate the resistance of the adhered cells. The microorganism adhered to stainless steel surfaces producing a cell load of 10⁴ CFU/cm². After alkaline cleansing, no adhered cells were detected but 6 CFU/cm² were still detected on the surfaces after acid cleansing. Cleansing, followed by sanification with sodium hypochlorite, was sufficient to reduce the load of wild S. thermophilus on the stainless steel surfaces to non-detectable levels. The experimental model proved adequate for the study indicating that the wild microorganism S. thermophilus produces biofilms on stainless steel surfaces. Alkaline cleansing remove more that 99.9% of the adhered cells. The few cells adhered on the surface are removed by acid cleansing demonstrating the need to use different steps and types of detergent for efficient cleansing. The best results for the removal of these biofilms are obtained by using alkaline cleansing followed by acid cleaning, this procedure being more efficient when complemented by sanification with sodium hypochlorite.

Keywords: Streptococcus thermophilus; adhesion; cleansing; sanification; stainless steel.

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1 – INTRODUÇÃO

Períodos prolongados de operação de pasteurizadores de leite podem levar o produto obtido nas horas finais de processamento a contagens elevadas de microrganismos, provocadas pela adesão e formação de biofilmes na superfície das placas do trocador de calor em sistema HTST, principalmente quando a temperatura das placas do lado do leite encontram-se na faixa de 45°C [1, 2, 9, 10]. Nesse processo, o fluxo de leite arrasta as células superficiais que se formam nesse biofilme elevando, gradativamente, as contagens do leite obtido nas horas finais do processo, podendo atingir 10ºUFC/mL ou mais após um tempo de operação do equipamento variando de 6 a 12h.

Dos microrganismos comumente presentes no leite pasteurizado, os Streptococcus contribuem com 4,9% [13] sendo desses, o Streptococcus thermophilus apontado como causador de adesão em sistemas de tratamento térmico de leite. Essa adesão de microrganismos pode ser fator determinante do tempo de operação desses trocadores de calor e da definição de parada durante a pasteurização para inclusão de limpeza intermediária com a finalidade de reduzir o crescimento desses microrganismos aderidos às placas.

A falta de controle e a não adequação da limpeza e sanificação adotadas para esses equipamentos com formação de biofilmes podem definir a extensão de possíveis problemas na qualidade e tempo de prateleira de leite pasteurizado e defeitos em queijos processados a partir de leite com altas contagens desses termodúricos.

O propósito do presente trabalho foi avaliar a adesão de Streptococcus thermophilus selvagem em superfície de aço inoxidável e o comportamento do biofilme frente à limpeza e sanificação, usando um modelo experimental de laboratório.

 

2 – MATERIAIS E MÉTODOS

Microrganismo: Streptococcus thermophilus selvagem com tempo de geração de 15,2 minutos [7], obtido a partir de amostras de leite pasteurizado por processo HTST em usina de beneficiamento, que apresentavam aumento da contagem total de microrganismos nas horas finais do processo de pasteurização.

Meio de crescimento e diluente: Leite em pó desnatado (Molico, Nestlé) reconstituído a 11%, esterilizado a 121°C/10 minutos, foi utilizado como meio de crescimento, repicagem e manutenção. Para diluição seriada das culturas foi utilizada água peptonada a 0,1%, estéril [15 ].

Modelo experimental para avaliação da adesão do microrganismo selvagem: O modelo experimental a seguir foi utilizado para avaliar a carga do microrganismo aderido e os efeitos das detergências alcalina e ácida e da sanificação sobre o biofilme formado pelo microrganismo selvagem.

O experimento foi dividido em duas fases:

1ª) adesão do microrganismo às placas de aço inoxidável e o efeito da detergência alcalina e ácida no biofilme formado em 6h de tempo de contato;

2ª) adesão do microrganismo às placas de aço inoxidável e o efeito da detergência alcalina e ácida e da sanificação no biofilme formado em tempo de contato de 6h.

Preparo do modelo experimental: Foram preparadas placas de aço inoxidável 316 medindo 20x100mm, com polimento sanitário (acabamento grana 180), todas devidamente numeradas, sendo a área teste delimitada por ranhura. Essas placas de aço inoxidável foram tratadas com detergente alcalino Liquibrite a 1% (Diversey do Brasil) à temperatura de 68-71°C/7 min. e, após enxágüe de 1 minuto, tratadas com detergente ácido Dilac-U a 1% (Diversey do Brasil) à temperatura ambiente por 3 min., seguido de novo enxágüe até a neutralidade. O mesmo procedimento foi adotado para tratamento dos ganchos de fio de aço inoxidável utilizados na fixação das placas.

Todo o material de vidro, hastes para agitação, ganchos e placas de aço inoxidável e água para enxágüe foram esterilizados a 121°C/20 min.

As placas de aço inoxidável foram penduradas por ganchos nas bordas de um frasco de vidro de 12,5cm de altura x 13cm de diâmetro, de modo que cobrissem toda a parede do frasco, tornando-as fixas nas devidas posições. Foi acrescentado ao frasco, assim preparado, 1500mL de leite desnatado reconstituído estéril, de maneira que as placas de aço inoxidável permanecessem submersas no leite. O modelo nessas condições foi colocado em agitação de 550rpm em banho maria bacteriológico a 45°C (FIGURA 1).

 

 

Método de contato para simulação da adesão em placas de pasteurizador: O modelo acima descrito foi mantido em condições assépticas e, quando a 45°C, foi inoculado com uma carga aproximada de 100UFC/mL do microrganismo selvagem. Esse sistema foi mantido sob agitação por um período de 6h. As amostragens foram realizadas nos tempos 0, 3 e 6h.

Método de detergência e sanificação: Para o procedimento de limpeza foi utilizada solução a 1% de detergente líquido alcalino forte (Liquibrite) com as seguintes características do fabricante: pH ~ 13 em solução a 3%, contendo além do alcali (NaOH a 44%) compostos tensoativos não iônicos, agentes seqüestrantes e controladores de espuma; solução a 1% de detergente líquido ácido (Dilac U) com características do fabricante de pH 1,5 a 1,9 em solução a 1%, acidez de 41 a 45% em ácido fosfórico contendo agentes umectantes, antiespumante, ácidos minerais (HNO₃ e H₃PO₄) e inibidores de corrosão, ambos da Diversey do Brasil. O hipoclorito de sódio com concentração 12%, fornecido pela ADR de Campinas foi utilizado numa concentração de 100ppm de cloro ativo para a sanificação. Água destilada estéril foi utilizada tanto no preparo das soluções de limpeza e sanificante quanto para enxágüe em todas as etapas do experimento.

As placas de aço inoxidável foram fixadas na borda do béquer através de ganchos de aço inoxidável com as devidas soluções ou águas de enxágüe, de maneira semelhante ao modelo da FIGURA 1, seguindo os tempos de contato estabelecidos (ESQUEMAS 2 e 3).

 

 

 

 

 

 

As placas, imediatamente após a retirada do leite, foram submetidas ao procedimento de limpeza e sanificação, conforme a seqüência de etapas especificadas no ESQUEMA 1.

As soluções dos detergentes, sanificante e água de enxágüe foram utilizadas num volume de 1800mL, volume este estabelecido em etapas preliminares para dar um pH final dessa água de enxágüe na faixa da neutralidade. Tanto as soluções quanto as águas de enxágüe foram utilizadas sob agitação de 900rpm em béquer de 2000mL com 13cm de diâmetro.

Amostragem para controle da carga do microrganismo: As amostragens na primeira fase foram realizadas conforme segue, adotando-se as seqüências de etapas do ESQUEMA 2:

0 hora:          10mL de leite;
                    2 placas para contagem do microrganismo aderido;
                    10mL da água de enxágüe das placas;
3 e 6 horas:  10mL do leite;
                    2 placas para contagem do microrganismo aderido;
                    10mL da água de enxágüe das placas;
                    2 placas após a detergência alcalina;
                    10mL da água de enxágüe das placas;
                    2 placas após a detergência alcalina e ácida;
                    10mL da água de enxágüe das placas.

As amostragens na segunda fase foram realizadas conforme segue, adotando-se as seqüência de etapas do ESQUEMA 3:

0 hora:          10mL de leite;
                    2 placas para contagem do microrganismo aderido;
                    10mL da água de enxágüe das placas;
3 e 6 horas:  10mL do leite;
                    2 placas para contagem do microrganismo aderido;
                    10mL da água de enxágüe das placas;
                    2 placas após a detergência alcalina, ácida e sanificação;
                    10mL da água de enxágüe das placas.

Foram realizados controle de pH das amostras de água de enxágüe, das soluções de limpeza alcalina e ácida e da solução de sanificante. Foi monitorada também a concentração de cloro ativo da solução sanificante [15].

Método de contagem do microrganismo: Para contagem do microrganismo no leite foram realizadas diluições seriadas em água peptonada, a partir de 10mL da amostra. Essas diluições foram semeadas em profundidade usando meio ágar M17 e incubadas a 45°C/24-48h [7, 10]. A mesma técnica de semeadura foi utilizada para contagem dos microrganismos remanescentes na água de enxágüe. O meio de cultura M17 foi formulado [18] em laboratório, usando reagentes Merck e ingredientes para meio de cultura marca Difco.

Para a contagem dos microrganismos aderidos nas placas de aço inoxidável foram utilizadas duas zaragatoas de algodão para cada placa de aço inoxidável, com esfregaço de 20 segundos para cada uma das zaragatoas. As zaragatoas foram recolhidas em 10mL de água peptonada e diluições sucessivas foram realizadas quando necessário, conforme abaixo especificadas [6]. As diluições foram semeadas em profundidade usando ágar M17 e incubadas a 45°C/24-48h [7, 10].

Para as contagens nas placas de aço inoxidável foram feitas as seguintes diluições: para adesão 1/10 (a 0 hora), 1/100 (na 3^a hora) e 1/10000 (na 6^a hora); para detergência alcalina, ácida e sanificação 1/5 (3^a e 6^a hora). As etapas de detergência e sanificação não foram realizadas nos tempos zero.

 

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

No modelo experimental utilizado, a linhagem selvagem de Streptococcus thermophilus aderiu às placas de aço inoxidável proporcionalmente ao aumento do número de células desse microrganismo no leite. Considerando os valores obtidos nas duas fases do experimento (TABELAS 1 e 2), uma carga de 5,2 a 5,9x10²UFC/mL inoculado no leite a 45°C resultou, após 3h, em uma carga microbiana de 2,0 a 2,1x10⁵UFC/mL e, após 6 horas, em contagens de 0,76 a 1,2 x10⁸UFC/mL no leite. Nesses tempos de contato, as concentrações de células aderidas variaram na terceira hora de 15,8 a 23,1UFC/cm² para 1,9 a 3,0x10⁴UFC/cm² na sexta hora, não sendo detectada adesão do microrganismo no tempo zero.

 

 

 

 

Os resultados obtidos neste experimento indicam que, partindo-se de uma carga microbiana de 5,2 a 5,9x10²UFC/mL no leite, após 3 horas ocorreu um aumento de 356 a 385 vezes na carga do microrganismo nesse substrato resultando em 15,8 a 23,1UFC/cm² aderidas na superfície das placas. Já um aumento de 380 a 571 vezes ocorreu nas 3 horas seguintes, partindo-se de uma carga de 2,0 a 2,1x10⁵UFC/mL no leite, aumentando o número de células aderidas nas placas em 1203 a 1299 vezes, conseqüentemente uma colonização muito mais expressiva das placas, a partir de contagens mais elevadas do microrganismo. Estas observações confirmam aquelas citadas por DUNSMORE & BATES [3] onde a carga de microrganismo aderida a uma superfície é dependente, entre outros fatores, do número de microrganismos presente no meio circundante em função do tempo de contato. Essa colonização das placas nos tempos estudados indicam que a linhagem selvagem isolada a partir deste trabalho produziu, em 3 horas, 11,8 gerações de células, uma tendência mais acentuada de crescimento em relação aos resultados obtidos por DRIESSEN [2] que obteve em estudo semelhante 8 gerações para uma linhagem selvagem de Streptococcus thermophilus.

Os resultados obtidos após a detergência alcalina e ácida das placas de aço inoxidável com adesão de S. thermophilus selvagem podem ser observados na TABELA 1. A carga de microrganismo na superfície das placas após limpeza alcalina foi reduzida para níveis não detectáveis, tanto para um tempo de contato de 3h quanto de 6h, ocorrendo portanto uma redução acentuada no número de células aderidas.

Uma maior dissociação de grupos ácidos pode ter ocorrido na etapa alcalina da limpeza pelo aumento da carga aniônica total sobre as moléculas do polímero formado durante a adesão [8], uma vez que o material envolvido na adesão normalmente é composto de polissacarídeos de origem ácida. Também, a maioria das superfícies de contato com solução aquosa são carregadas negativamente, assim um aumento na repulsão eletrostática de tais superfícies pode ter provocado uma maior dispersão das células do biofilme. Essa alteração de carga no meio circundante pode ainda ter provocado um aumento do número de cargas nas moléculas dos polímeros extracelulares, determinando mudanças na sua conformação. Com o aumento da repulsão intramolecular, a cadeia desse polímero ao redor da célula pode tornar-se mais estendida, evitando a aproximação desta com a superfície, diminuindo portanto as influências de pequenas forças e facilitando a soltura das células [12].

O mesmo, porém, não ocorreu nas placas com 6h de contato após as fases alcalina e ácida da limpeza quando, ainda que em pequenos números, células viáveis do microrganismo foram detectadas nas placas de aço inoxidável (TABELA 1). Estes resultados de adesão foram obtidos em 3 das 5 repetições realizadas, variando as contagens na fase de adesão em 6h antes da limpeza, de 2,6 a 6,2x10⁴UFC/cm², enquanto nas outras repetições foram detectadas um menor número de células aderidas. Estes resultados podem ter sido influenciados pelo procedimento de amostragem utilizado, que remove somente as bactérias fracamente aderidas nas superfícies [4]. Assim, os compostos alcalinos da detergência durante a limpeza podem ter dispersado as estruturas de adesão e grande parte das células do biofilme formado, liberando as células fracamente aderidas, já que houve uma redução na contagem do microrganismo na etapa alcalina da limpeza. Por outro lado, as células com estruturas mais fortemente ligadas provavelmente ficaram retidas à superfície, através de algum componente removido ou solubilizado pelo detergente ácido usado durante essa etapa da limpeza.

De acordo com PASSOS E KUAYE [14], tanto o tratamento alcalino quanto o ácido não são suficientes para a completa remoção de proteínas e minerais que compõem o material incrustante em pasteurizador de leite, podendo estes resíduos influenciar no processo da adesão de microrganismos. Também o cálcio contribui nesse processo, já que microrganismos que se desenvolvem em ausência de cálcio podem facilmente ser removidos de superfícies [5].

Os resultados deste trabalho parecem indicar que o detergente ácido pode ter contribuído para a liberação das células remanescentes fortemente aderidas à superfície das placas de aço inoxidável, detectadas em número bastante reduzido após a limpeza alcalina e ácida. O detergente ácido, tendo uma ação mais efetiva na remoção de minerais como o cálcio pode ter contribuído na liberação das células remanescentes ligadas por esse tipo de substância na superfície estudada.

Após a limpeza alcalina e ácida, uma sanificação com hipoclorito de sódio a 100ppm de cloro ativo foi utilizada (TABELA 2). Os resultados indicaram que, nos diferentes tempos amostrados, a detergência e sanificação mostraram-se suficientes para reduzir a carga de S. thermophilus selvagem aderidos na superfície de aço inoxidável para níveis não detectados.

A seqüência de etapas envolvidas na detergência, associada à sanificação com hipoclorito de sódio a 100ppm avaliado neste estudo, parece ter sido suficiente para reduzir muito a carga de células do S. thermophilus selvagem nas placas de aço inoxidável. Assim, a seqüência de etapas incluídas no processo de higienização utilizando detergência alcalina e ácida seguida de sanificação, parece ser fundamental na remoção do biofilme do microrganismo aderido em superfícies.

Considerando as diferentes etapas utilizadas na higienização, a limpeza das placas inicialmente pelo pré-enxágüe parece remover, além da matéria orgânica, células superficiais envolvidas no biofilme, facilitando a ação do detergente alcalino. Esta detergência, além de remover a maior parte do material aderido poderia provocar uma provável dispersão das substâncias do biofilme permitindo a ação do detergente ácido. Quantidades mínimas de células remanescentes na superfície das placas, já expostas e estressadas pela ação dos agentes de limpeza, parecem sofrer facilmente a ação oxidante do sanificante clorado. A seqüência completa das etapas utilizadas no modelo experimental proposto mostrou ter boa ação na remoção e desinfeção do Streptococcus thermophilus linhagem selvagem aderidos na superfície de aço inoxidável em meio com leite.

Estes resultados concordam com as observações realizadas por SCHWACH & ZOTTOLA [16] de que um enxágüe em superfície de aço inoxidável contendo células bacterianas antes da sanificação, não é suficiente para a remoção das células aderidas, havendo necessidade do uso da detergência com diferentes agentes químicos antes dessa etapa. Essa mesma constatação foi feita por KRISYNSKI [11] que obteve os melhores resultados para diferentes superfícies quando tratamento com detergente foi associado à sanificação.

Também a metodologia e o modelo experimental utilizados neste experimento mostraram-se adequados para a avaliação da carga de microrganismos em superfície, provavelmente pelas repetições do teste nas mesmas condições, de maneira análoga. Estas condições são muitas vezes mais importantes na avaliação dos efeitos da limpeza em uma superfície do que o uso de metodologia eficiente na recuperação de um maior número de microrganismos [17].

 

4 – CONCLUSÕES

O modelo experimental mostrou-se adequado para este estudo indicando que a cultura selvagem de Streptococcus thermophilus é produtora de biofilme em superfície de aço inoxidável, sendo que o número de células no biofilme aumenta com o aumento do número de células do microrganismo no meio circundante.

A limpeza da superfície de aço inoxidável por detergência alcalina remove mais que 99,9% das células do microrganismo aderidas a essa superfície. Pequenos números de células remanescentes são também removidas na detergência ácida, o que demonstra a necessidade das diferentes etapas e diferentes tipos de detergentes na eficiência da limpeza desse tipo de superfície.

Melhores resultados na remoção das células do biofilme formado pelo Streptococcus thermophilus em superfícies de aço inoxidável consegue-se com a prática de detergência alcalina seguida de detergência ácida e mais eficientemente quando se utiliza uma sanificação complementar com hipoclorito de sódio.

 

5 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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¹ Recebido para publicação em 25/03/97. Aceito para publicação em 17/02/00.

² Departamento de Tecnologia de Alimentos – Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP – Campinas – SP – Brasil CEP 13081-970. Cx. Postal 6121, agandara@fea.unicamp.br

* A quem a correspondência deve ser enviada.