BIOQUÍMICA CLÍNICA

Niveles de la enzima superóxido dismutasa en niños normotensos, prehipertensos e hipertensos

Levels of superoxide dismutase enzyme in normotensive, prehypertensive and hypertensive children

Niveis da enzima superoxido dismutasa nas crianças normotensas, prehipertensas e hipertensas

 

Jesús Alfonso Rodríguez¹, Danay Heredia Ruiz², Douglas Fernández Caraballo³, Marianela Ballestero Hernández⁴, Emilio González Rodríguez⁵, Miriam Lara Suarez⁶

1 Lic., Master y Profesor Auxiliar de la Universidad de Ciencias Médicas de Villa Clara.
2 Lic., Master y Profesora Asistente de la Universidad de Ciencias Médicas de Villa Clara.
3 Lic., Master y Profesor Asistente de la Universidad de Ciencias Médicas de Villa Clara.
4 Especialista de 1er Grado de Fisiología, Master y Profesora Asistente de Universidad de Ciencias Médicas de Villa Clara.
5 Dr. en C. Técnicas, Master y Profesor Titular de la Universidad Central de Las Villas.
6 Licenciada en Laboratorio Clínico del Policlínico José Ramón Acosta.

Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Química Sanguínea de la Unidad de Investigaciones Biomédicas de la Universidad Ciencias Médicas de Villa Clara, Cuba.

 

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Resumen

La hipertensión arterial en los niños se ha convertido en un problema importante de salud, debido a la frecuencia con que se presenta en la actualidad. Las Especies Reactivas del Oxígeno son uno de los mecanismos involucrados en la fisiopatología de la hipertensión arterial. El objetivo del trabajo fue evaluar la actividad de la enzima superóxido dismutasa y las proteínas totales, por los métodos de Marklund y Lowry en 335 escolares de cuatro escuelas primarias de Santa Clara, según el sexo, color de piel, edad e índice de masa corporal. Para determinar las diferencias significativas entre los niños normotensos, prehipertensos e hipertensos, se utilizaron los tests de Student, Kruskal-Wallis y de Mann-Whinney, todos del software estadístico SPSS 15. Los prehipertensos e hipertensos tuvieron una disminución significativa de la actividad de la superóxido dismutasa. Algo similar ocurrió con los niños hipertensos de sexo masculino, de piel blanca, de 8 años de edad y con los normopesos.
La afectación de esta enzima en los niños hipertensos puede favorecer la presencia de Especies Reactivas del Oxígeno y con ello de daños oxidativos.

Palabras clave: Hipertensión; Prehipertensión; Superóxido dismutasa; Anión superóxido; Especies reactivas del oxígeno

Summary

High blood pressure in children has become a major health problem due to the frequency this disease is appearing today. Reactive oxygen species is one of the mechanisms involved in the pathophysiology of hypertension. The objective of this paper was to evaluate the activity of the superoxide dismutase enzyme and total proteins by the Lowry and Marklund methods in 335 students from four elementary schools in Santa Clara, according to sex, color, age and body mass index. To determine significant differences between normotensive, prehypertensive and hypertensive children, Student's tests, and Kruskal-Wallis and Mann-Whinney tests, which are part of the SPSS 15 statistical package, were used. Superoxide dismutase activity had a significant decrease in prehypertensive and hypertensive students. Something similar happened in male, white children, 8 years of age with high blood pressure, and with the ones of normal weight. When the activity of this enzyme is affected in children with high blood pressure, it can lead to the presence of reactive oxygen species and thus of oxidative damage.

Key words: High blood pressure; Prehypertension; Superoxide dismutase; Superoxide anion ; Reactive oxygen species

Resumo

A hipertensão arterial nas crianças tem se transformado em um problema importante de saúde devido à frequência com que atualmente se está apresentando. As Espécies Reativas do Oxigêno são um dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia da hipertensão arterial. O objetivo do trabalho foi avaliar a atividade da enzima superóxido dismutase e das proteínas totais, pelos métodos de Marklund e Lowry em 335 crianças de 4 escolas primárias de Santa Clara, segundo o sexo, a cor da pele, a idade e o índice de massa corporal. Para determinar as diferenças significativas entre as crianças normotensas, pré-hipertensas e hipertensas foram utilizados os testes de Student, Kruskal-Wallis e de Mann-Whinney, todos do software estatístico SPSS 15. Os pré-hipertensos e hipertensos tiveram uma diminuição significativa da atividade da superóxido dismutase. Algo semelhante aconteceu com as crianças hipertensas de sexo masculino, de pele branca, de 8 anos de idade e com os normopesos. A afetação desta enzima nas crianças hipertensas pode favorecer a presença de Espécies Reativas do Oxigênio e com isso danos oxidativos.

Palavras chave: Hipertensão; Pré-hipertensão; Superóxido dismutase; Ânion superóxido; Espécies reativas do oxigênio

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Introducción

La hipertensión arterial (HTA) en niños se ha convertido en un problema importante de salud, debido a la frecuencia con que se presenta en la actualidad, a diferencia de lo que ocurría en décadas pasadas. Hansen et al plantearon que la frecuencia de HTA en la infancia se estima entre 2 y 5% ⁽¹⁾. Sin embargo, el número de niños hipertensos es realmente mayor, como reportaron Feber et al, donde la estimaron entre 7,4% en Canadá y 17,3% en Brasil ⁽²⁾. Este equipo multidisciplinario de trabajo encontró en cuatro escuelas primarias de la Ciudad de Santa Clara, Cuba, cerca de un 10% de niños con este padecimiento. Farner et al en su trabajo sobre variabilidad de la presión sanguínea y su clasificación en adolescentes, demostraron la importancia de la pre hipertensión, al encontrar una progresión del 7% anual, de pre hipertensos a hipertensos ⁽³⁾. Numerosos estudios han demostrado que las alteraciones de la presión arterial (PA) en la infancia y en la adolescencia se convierten en HTA en la adultez ⁽⁴⁾. Tal afección se considera el principal factor de riesgo de las Enfermedades Cardiovasculares (ECV) como son las afectaciones coronarias, cerebrales, renales y del sistema vascular periférico ⁽⁵⁾. Existen también múltiples evidencias por estudios clínicos, epidemiológicos y patológicos, del comienzo de la aterosclerosis desde los primeros años de vida ⁽⁶⁾. Numerosos mecanismos o causas de HTA han sido caracterizados en los últimos años, como los de vasoconstricción incluyendo los sistemas renina-angiotensina, nervioso simpático, de endotelina, de vasopresina y más recientemente el de las Especies Reactivas del Oxígeno (ERO) ⁽⁷⁾. Una amplia cantidad de evidsencias apoyan la idea de que las ERO están involucradas en la patogénesis de la HTA ⁽⁸⁾. Segura et al encontraron un aumento del estrés oxidativo (EO) estudiando HTA en jóvenes. Chaplau señaló que numerosos estudios han demostrado que un aumento en la producción de ERO en los vasos sanguíneos y en el riñón aporta evidencias que el EO en estos órganos causa o contribuye al aumento de la PA ⁽⁵⁾. Por otra parte, estudios experimentales in vitro en animales o en humanos, sostienen la hipótesis que un incremento en el EO pudiera desencadenar la remodelación vascular, así como un aumento de la PA ⁽⁹⁾. La HTA se asocia con la disfunción endotelial en la que juega un papel importante el EO y un estado pro- inflamatorio ⁽¹⁰⁾. El EO puede ser debido a que existe una sobreproducción de las especies oxidantes o que existe una disminución de las defensas antioxidantes. Cohen et al en su trabajo sobre EO vascular plantearon que en pacientes hipertensos adultos, la enzima antioxidante superóxido dismutasa (SOD) tuvo una disminución significativa en sangre y células mononucleares, cuando se comparó con sujetos normales ⁽¹¹⁾. El presente trabajo evaluó y determinó la actividad de la superóxido dismutasa en niños normotensos, prehipertensos e hipertensos según el sexo, color de piel, la edad y el índice de masa corporal (IMC).

Materiales y Métodos

El estudio forma parte del Proyecto PROCDEC eje¬cutado por las Universidades Central "Marta Abreu" de Las Villas, de Ciencias Médicas "Serafín Ruiz de Zárate Ruiz" de Villa Clara y el Sectorial Provincial de Salud de Villa Clara, el cual desarrolló una pesquisa integral para la detección temprana de niños pre-hipertensos e hipertensos con intervención, en cuatro Escuelas Pri¬marias del municipio de Santa Clara, Villa Clara, Cuba.
Se obtuvo el consentimiento informado de todos los padres involucrados en el estudio, una vez que se les explicó en qué consistía el mismo, su importancia y el beneficio personal y familiar.
Participaron 335 niños, 167 del sexo masculino y 274 de piel blanca, entre las edades de 8 y 11 años, a los cuales se les midió la PA en 8 momentos, para lograr su clasificación en normo, pre o hipertensos. Se utilizaron brazaletes del tamaño adecuado a la circunferencia del brazo, de tal forma que la bolsa neumática interna abarcó más del 50% de la circunferencia del brazo, medida en el punto medio entre el acromion y el olécranon. El estetoscopio utilizado fue de tamaño pediátrico.
Para la medición, los infantes permanecieron al menos 10 minutos sentados en estado de reposo y con el antebrazo apoyado sobre una mesa, garantizando como mínimo un intervalo de 10 minutos entre las tomas y en tres días diferentes, como establece la OMS. También se incluyó la toma de un miembro inferior acostado, para descartar la coartación de la aorta. Para la obtención del diagnóstico, se utilizaron las tablas de percentiles de talla y PA de la referencia ¹², que consideran la edad y el sexo. Se consideraron hipertensos aquellos niños que reportaron cifras de PA por encima del percentil 95, pre-hipertensos los que tuvieron un percentil entre 90 y 95 y normotensos aquellos con menos del percentil 90 ⁽¹²⁾.
A cada niño se le extrajeron 10 cc de sangre con jeringa desechable en la condición de ayuno total de 12 horas como mínimo y dieta normo calórica y normo lipídica en la última comida, con previo consentimiento y participación de sus padres o tutores. Las muestras de sangre fueron procesadas, separándose el suero de los glóbulos mediante centrifugación y el suero resultante se distribuyó en 3 laboratorios, donde se estudiaron los parámetros bioquímicos convencionales, los micro y macro elementos y además la actividad de las enzimas.
La determinación de la SOD se efectuó por el método de Marklund et al ⁽¹³⁾, basado en la autooxidación del pirogalol en soluciones aeróbicas, el cual fue catalizado por el radical anión superóxido (O₂.-), dando lugar a la purpurogalina, compuesto amarillo marrón que absorbe la luz a 420 nm y resulta inhibido por la enzima SOD. El grado de inhibición permitió evaluar la cantidad de enzima presente en la muestra. Es necesario eliminar previamente los lípidos del suero con una mezcla de cloroformo y metanol (30 mL de clorofomo y 50 mL de metanol en frío por cada 100 mL de suero) antes de ser utilizado. Posteriormente se mezclaron en una cubeta de cuarzo 50 µL del suero obtenido y se le añadieron 900 µL del buffer Tris-HCl a pH 8,20 y 50 µL de la solución de pirogalol. Después de 10 segundos de reacción se determinó la diferencia de Densidad Óptica en un minuto a 420 nm. Además, se preparó otra muestra blanco con los mismos pasos anteriores, pero con la utilización de 50 µL de agua destilada en lugar de muestra. Este procedimiento se repitió al menos tres veces garantizándose siempre la obtención de una ΔDO entre 0,020-0,025. La actividad de la enzima se reportó en Unidad de Actividad Enzimática por miligramo de proteínas (Actividad Específica).
Las proteínas totales fueron determinadas por el método de Lowry ⁽¹⁴⁾. Para conocer si la muestra cumplía con la distribución normal, se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov (n ≥100) y de Shapiro-Wilk (n ≤100). Cuando la distribución de la muestra fue normal, se utilizó el test de Student, pero si no cumplía la condición, se utilizaron los tests no paramétricos Kruskal-Wallis y de Mann-Whinney, para conocer si existió diferencia significativa para p<0,05 y medianamente significativa de p<0,10 entre los grupos estudiados. Todos los tests que se utilizaron pertenecen al software estadístico de SPSS 15.0. Las determinaciones fueron realizadas en un espectrofotómetro Génesis 10 UV (Thermo Electron Corporation Madison EEUU.), en el Laboratorio de Química Sanguínea de la Universidad de Ciencias Médicas de Villa Clara. Los reactivos utilizados fueron de alta calidad y pertenecientes a las firmas Merck y Sigma.

Resultados

La actividad de la enzima SOD en los niños prehipertensos (0,062±0,040*) e hipertensos (0,052±0,027*) tuvo una disminución significativa cuando al ser comparada con los normotensos (0,074±0,045), como muestra la Figura 1. Con relación al sexo, los varones prehipertensos (0,059±0,036*) e hipertensos (0,045±0,028+), presentaron también una disminución de la actividad de la SOD siendo significativa y medianamente significativa cuando se compararon con los normotensos (0,073±0,043), como aparece en la Figura 2.

Figura 1. Valores de la superóxido dismutasa en los niños según clasificación.

Figura 2. Valores de la superóxido dismutasa según el sexo y la clasificación de los niños.

Según el color de la piel, la actividad de esta enzima en los escolares prehipertensos (0,057± 0,039*) e hipertensos (0,055±0,028*) blancos tuvo una disminución significativa al compararse con los normotensos (0,075±0,046), como muestra la Figura 3. También los hipertensos de 8 años de edad tuvieron una disminución significativa (0,044±0,023*) y los prehipertensos de 10 años una disminución medianamente significativa (0,051±0,027*), con relación a los normotensos (0,077±0,041 y 0,067±0,047 respectivamente) como se demuestra en la Figura 4.

Figura 3. Valores de la superóxido dismutasa según el color de la piel y la clasificación de los niños

Figura 4. Valores de la superóxido dismutasa según la edad y la clasificación de los niños.

El estudio del IMC encontró diferencia significativa de la actividad de la SOD en los niños normopesos prehipertensos (0,060±0,038*) e hipertensos (0,046±0,028*) al relacionarse con los normotensos (0,075 ± 0,043), no así en los sobrepesos y obesos, según muestra la Figura 5. Los varones blancos prehipertensos tuvieron una disminución significativa (0,053±0,037*) y los hipertensos medianamente significativos (0,045±0,028+), al compararlos con el grupo control (0,075±0,044), lo que se observó en la Figura 6.

Figura 5. Valores de la superóxido dismutasa según el IMC y la clasificación de los niños.

Figura 6. Valor de la superóxido dismutasa en niños de piel blanca según el sexo y su clasificación.

El grupo de varones hipertensos de 8 años presentó una disminución significativa(0,020±0,012*) en la actividad antioxidante de la SOD, al referirlo a los niños normales (0,074±0,039) como aparece en la Figura 7, mientras que los escolares blancos hipertensos de ambos sexos de 8 años presentaron una disminución significativa (0,050±0,020* y 0,020±0,012*) y las mujeres prehipertensas una disminución medianamente significativa (0,059±0,044+), al analizarlo con los normotensos (0,084±0,045 y 0,076±0,042) como muestra la Figura 8.

Figura 7. Valores de la superóxido dismutasa en niños de piel blanca y 8 años según el sexo y su clasificación.

Figura 8. Valores de la superóxido dismutasa en niños de piel blanca de 8 años de edad según su sexo y clasificación.

Discusión y Conclusiones

La disminución de la actividad de la enzima SOD en los niños pre hipertensos e hipertensos (Figura 1), coincide con la obtenida por Cohen y Shuvaev en estudios realizados en humanos y en animales de experimentación ^{(11) (15)}. El descenso de la actividad de la SOD en individuos hipertensos también está acorde con lo planteado por Touyz y Briones ⁽¹⁶⁾. Este resultado indica la posibilidad de que el sistema antioxidante de estos niños pudiera estar afectado, conociendo que la SOD es uno de los principales exponentes del sistema antioxidante endógeno, encargado de eliminar el O₂.- a partir del cual se forma el resto de las ERO. En ambos sexos, los escolares prehipertensos e hipertensos tuvieron una disminución de la actividad de esta enzima, como se observa en la Figura 2, siendo ésta más marcada en los varones que en las mujeres. En este resultado puede estar influyendo la presencia de estrógenos en las niñas que se encuentran en o cerca de la pubertad, etapa donde comienza a estar presente esta hormona, como plantearon Xue et al, al señalar que los estrógenos centrales actúan inhibiendo la generación de las ERO y al disminuir [Ca2+] inducida por la Angiotensina II (ANG II). Estos mismos autores sostienen que el efecto antihipertensivo del estrógeno está mediado al menos en parte por el Óxido Nítrico (ON) y sugieren que la protección cardiovascular del estrógeno contra el EO favorecido por ANG II es debida al incremento inducido de la actividad de la enzima SOD ⁽¹⁷⁾. Por otra parte, López Ruiz et al plantearon que las ratas hipertensivas espontáneas constituyen un modelo genético de hipertensión esencial, en las cuales la presión sanguínea fue mayor en los machos que en las hembras y se ha demostrado que en los primeros, la hipertensión que presenta es mediada por el EO ⁽¹⁸⁾. Los niños blancos prehipertensos e hipertensos presentaron una afectación significativa de la actividad de la enzima SOD, pero no fue así en los niños no blancos, como se observa en la Figura 3. Según Silventein estos resultados no concuerdan con los estudios previos realizados para la detección de HTA en niños, donde se encontró que los no blancos tenían una tendencia mayor a HTA que los de piel blanca ⁽¹⁹⁾. En este resultado pudo haber incidido la composición de la muestra estudiada, donde el 82% pertenecía a niños blancos. Los niños hipertensos de 8 años de edad fueron los que presentaron la actividad significativamente más baja, como detalla la Figura 4. Estos resultados discrepan de los hallados por Xue y Silvertein et al, quienes utilizando el Monitoreo Ambulatorio de la Presión Arterial, mostraron que con el incremento de la edad aumenta la PA en ambos sexos ^{(18) (19)}. Se encontró que los niños con sobrepeso y obesos presentaron estrés oxidativo e hipertensión ^{(20) (21)}. Sin embargo, en este estudio los niños normopesos diagnosticados como prehipertensos e hipertensos fueron los afectados, ya que presentaron una disminución significativa de la actividad de esta enzima atendiendo al IMC, como se observa en la Figura 5. En el caso de estos niños que son normopesos pero hipertensos, puede estar influyendo otro factor de riesgo como es el hereditario. Cuando se analizó el sexo de los niños blancos se ratificó que hipertensos varones presentaron una disminución significativa de la enzima, como muestra la Figura 6 y un resultado similar se obtuvo al combinar el sexo con la edad de 8 años, según se observa en la Figura 7. Sin embargo, cuando se analizó el comportamiento de la SOD de forma conjunta atendiendo al sexo, color de piel blanca, edad 8 años y a su clasificación, se encontró que la actividad de esta enzima estuvo afectada significativamente en los niños hipertensos en ambos sexos, como muestra la Figura 8. Atendiendo a la función de la enzima, que es la eliminación del O₂.- al transformarlo en peróxido de hidrógeno y a la disminución de su actividad, este resultado puede favorecer un aumento de esta ERO por parte de las células vasculares incluyendo las células endoteliales ⁽²²⁾. Por otra parte, este incremento puede estar reforzado en la hipertensión por la principal fuente generadora de O₂.- que es la enzima NADPH oxidasa vascular, la que es estimulada por la hormona hipertensiva ANG II ^{(22) (23)}. El aumento del O₂.- puede provocar una acción vasoconstrictora, ya que secuestra al ON y con ello disminuye su acción vasodilatadora, vasoprotectora y anti aterogénica ⁽¹⁵⁾. La interacción de estas dos últimas especies reactivas, da lugar al anión peroxinitrito (ONOO-), que es un compuesto altamente tóxico y oxidante para la célula ⁽²²⁾. El ONOO- es un compuesto altamente reactivo con grupos químicos de las proteínas, favoreciendo su nitración y con ellos la inactivación de enzimas tan importantes como la prostaciclina sintetasa y las tres formas isoenzimáticas de la SOD ^(11)(24). Además, el ONOO- oxida a la tetrahidrobiopterina, que es uno de los cofactores de la Sintetasa de la Óxido Nítrico Endotelial, lo que provoca su desacoplamiento y con ello se favorece la producción de O₂.- ⁽²⁵⁾ y también favorece la formación de los isoprostanos-F2, los cuales son una familia de potentes agentes pro-inflamatorios y vasoconstrictores ⁽²⁶⁾. La disminución de la SOD fundamentalmente está presente en lo niños prehipertensos e hipertensos del sexo masculino, de color de piel blanca, de 8 años de edad y normopesos. Los eventos moleculares que pueden estar favorecidos por la acumulación de O₂.- debido a una disminución de la enzima SOD, pudieran explicar una parte de la participación de las ERO en los mecanismos fisiopatológicos de HTA, así como la presencia de daños oxidativos en los hipertensos.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo del proyecto PROCDEC en recursos humanos y materiales que permitieron la realización del presente trabajo.

Correspondencia

Msc Jesús Alfonso Rodríguez
Juan Bruno Zayas 174 B e/ Candelaria y San Cristóbal Santa Clara Villa Clara, Cuba.
E-mail: jesusar@ucm.vcl.sld.cu

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Aceptado para su publicación el 2 de noviembre de 2011