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Revista de Saúde Pública
Print version ISSN 0034-8910
Rev. Saúde Pública vol.33 n.3 São Paulo Jun. 1999
http://dx.doi.org/10.1590/S0034-89101999000300009
Problemas na padronização da reação em cadeia da polimerase para diagnóstico da tuberculose pulmonar*
Problems in the standardization of the polymerase chain reaction for the diagnosis of pulmonary tuberculosis
Valdes R. Bollela, Daisy N. Sato e Benedito A. L. Fonseca
Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Ribeirão Preto, SP - Brasil (VRB, BALF); Instituto Adolfo Lutz de Ribeirão Preto. Ribeirão Preto, SP - Brasil (DNS)
Descritores Tuberculose pulmonar, diagnóstico. Reação em cadeia por polimerase. Mycobacterium tuberculosis. | Resumo Objetivo Métodos Resultados Conclusões |
Keywords Tuberculosis, pulmonary diagnostic. Polymerase chain reaction. Mycobacterium tuberculosis. | Abstract Introduction Methods Results Conclusions |
INTRODUÇÃO
Estima-se que um terço da população mundial está infectada pelo Mycobacterium tuberculosis, que é a causa de aproximadamente 8 milhões de novos casos e 3 milhões de mortes por ano14. Em várias regiões do mundo a tuberculose ainda é a principal causa de morte por um agente infeccioso isoladamente. Cerca de 26% de todas as mortes evitáveis no mundo são diretamente relacionadas à tuberculose14, que nunca deixou de ser um grave problema de saúde pública nos países em desenvolvimento. No entanto, a partir da década de 80, com a disseminação da infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e a deterioração dos programas de controle da doença, a tuberculose retorna como importante questão de saúde pública nos países desenvolvidos da América do Norte e Europa. Dados da Fundação Nacional de Saúde6, de 1996, mostram que o Brasil convive com 90 mil novos casos de tuberculose anualmente, morrendo cerca de cinco mil pessoas neste período. A região Sudeste é a mais atingida, com mais de 50% dos casos6. O indivíduo co-infectado (M. tuberculosis e HIV) tem risco 6 a 100 vezes maior de adoecer de tuberculose do que o indivíduo infectado apenas com o M. tuberculosis11. Dados do Centro de Vigilância Epidemiológica do Estado de São Paulo13, de 1994, mostravam que cerca de 14,7% dos casos novos de tuberculose apresentavam sorologia positiva para o HIV. Desde abril de 1993, a Organização Mundial da Saúde considera a tuberculose uma emergência global incentivando medidas de controle da doença em todo o mundo. Sem mudança nas condições socioeconômicas da população o controle da tuberculose reside no diagnóstico precoce e tratamento efetivo, além da vacinação e quimioprofilaxia para os contactantes.
Embora o diagnóstico presuntivo da tuberculose possa ser feito através de dados da história clínica e achados radiológicos, o diagnóstico definitivo ainda depende da baciloscopia e cultura. A microscopia direta após coloração pelo Ziehl-Neelsen, em busca de bacilos álcool ácido resistentes (BAAR), é um método rápido e barato. No entanto, tem baixa sensibilidade e especificidade. São necessários, no mínimo, 5.000 bacilos para que o teste seja positivo. Apesar de ser o padrão para a confirmação diagnóstica da tuberculose, a cultura requer de 4 a 8 semanas para um diagnóstico definitivo, pela própria característica de replicação lenta do M. tuberculosis9.
A mais promissora técnica para o diagnóstico rápido da tuberculose é baseada na reação em cadeia da polimerase (PCR), técnica capaz de detectar até uma cópia de DNA de qualquer célula1,2. Além de alta sensibilidade e especificidade, esta técnica é capaz de produzir resultados em algumas horas. A amplificação específica de seqüências de ácidos nucléicos através da PCR tem sido empregada no diagnóstico de inúmeras doenças infecciosas8. Vários protocolos com diferentes "primers", número de ciclos e tratamento de amostras vêm sendo desenvolvidos para o diagnóstico rápido da tuberculose4, 6.
Conhecendo a complexidade das técnicas de biologia molecular, buscou-se padronizar uma reação que pudesse ser realizada de maneira simplificada e fosse facilmente reproduzida em laboratórios com recursos mínimos para a realização do teste.
MÉTODOS
Cepa de Referência e Espécimes Clínicos
A cepa de referência de Mycobacterium tuberculosis HRa37 foi usada para a padronização dos parâmetros da reação e avaliação da sensibilidade da PCR, em relação à quantidade de cópias de genoma do M. tuberculosis que seriam detectadas por essa técnica.
Amostras de escarro de 42 pacientes, enviadas ao laboratório, entre janeiro e março de 1996, foram avaliadas pela técnica da auramina-rodamina e Ziehl-Neelsen em busca de BAAR, e em seguida tratadas para cultivo em Lowenstein-Jensen e PCR.
Processamento das Amostras de Escarro
Todas as amostras foram descontaminadas pelo método de Petroff, com NaOH 4%9. Após ser semeado em meio sólido, o material restante foi estocado a -20oC em "eppendorfs" de 1,5 ml.
Extração do DNA
Técnica adaptada de Kocagöz et al.8 consistiu da lavagem repetida do sedimento do escarro com Tris-HCl EDTA (TE), 10mM Tris pH = 8,0 e 1mM EDTA, por 3 vezes, e centrifugadas a 13.500 rpm. Após cada centrifugação, o sedimento era suspenso em 500 µl de tampão TE e agitado vigorosamente por 30 s. Na última vez, o "pellet" foi suspenso em 50 µl de TE, fervido 10 min e centrifugado a 13.500 rpm por 5 min. Cinco microlitros do sobrenadante foi usado para a PCR.
"Primers"
Os "primers" usados no presente trabalho foram originalmente descritos por Eisenach et al.4 e amplificam uma seqüência de inserção repetitiva do genoma de micobactérias do Complexo M. tuberculosis (IS6110). O produto da amplificação são fragmentos de 123 pares de base. A seqüência dos "primers" é vista na Tabela 1.
Protocolo de Amplificação do DNA
Utilizaram-se reagentes do "kit" GeneAmp®. Para volume final da reação de 50µl, 5µl do DNA extraído foi acrescentado a 45µl da mistura de reagentes da PCR contendo 1,25 U de Taq DNA polimerase, 200 µM de cada desoxinucleotídeo, tampão da Taq DNA polimerase (10mM Tris-HCl, pH 8,3; 50 mM KCl; 0,15 mM MgCl2; 0,01% gelatina), 20 pmol de cada "primer".
A amplificação consistiu de uma fase inicial a 94oC por 5 min; 35 ciclos com 1 min a 94oC para desnaturação, 2 min a 65oC para ligação dos "primers" ao molde genômico e 1 min a 72oC na extensão do amplificado, em cada ciclo. Ao final manteve-se a temperatura em 720C por 10 min para a polimerização dos fragmentos incompletos. O amplificado de 123 pares de base foi separado por eletroforese em gel de agarose a 3%, corado com brometo de etídio 1µg/ml, analisado em transiluminador de luz ultravioleta e fotografado em máquina Polaroid DS34.
Controles da PCR
A cada amplificação das espécimes clínicas, os controles positivos com DNA, extraído da cepa de referência, e os negativos com todos os reagentes da PCR acrescidos de 5µl de TE, usado para lavar as amostras de escarro, eram feitos simultaneamente.
Análise de Sensibilidade e Especificidade
Foi feita nos moldes clássicos da epidemiologia, avaliando-se os resultados em Tabela 2X2 para obter sensibilidade, especificidade, valores preditivo positivo e negativo da PCR comparada à cultura do M. tuberculosis em meio sólido de Lowenstein-Jensen.
RESULTADOS
A padronização da PCR requer processamento criterioso das amostras para evitar intercorrências que podem interferir nos resultados do teste. Após a amplificação, observou-se a presença da banda de 123 pares de base na definição dos positivos nas amostras (Figura).
Das 42 amostras de escarro enviadas ao laboratório, 10 apresentaram resultados positivos à baciloscopia, sendo duas dessas com cultura negativa. Dez amostras foram positivas com crescimento de M. tuberculosis, no cultivo em meio sólido de Lowenstein-Jensen, e 16 mostraram-se positivas na PCR (Figura). Em uma amostra positiva na PCR a cultura contaminou e foi excluída da análise. A sensibilidade e especificidade do teste em relação à cultura, considerada o padrão-ouro para a confirmação diagnóstica, foi de 90% e 81%, respectivamente. Os valores preditivo positivo e negativo foram 60% e 96%, respectivamente (Tabela 2).
DISCUSSÃO
A grande dificuldade no diagnóstico da tuberculose reside no tempo necessário para a confirmação diagnóstica. Atualmente, com o aumento no número de co-infecção tuberculose e HIV, além de apresentações atípicas, depara-se com pacientes muito graves que precisam de instituição de terapêutica rápida e precisa. A associação do HIV e outras micobacterioses tem se tornado freqüente, devendo ser considerada no diagnóstico diferencial da tuberculose. A baciloscopia além de pouco sensível, é incapaz de diferenciar estas duas situações comuns para o clínico e infectologista. A cultura apesar da alta especificidade, demanda tempo para o resultado, tempo que geralmente não é disponível frente a casos graves, como os de imunodeficientes. A letalidade da tuberculose em indivíduos infectados pelo HIV pode ser 2,4 a 19 vezes maior que nos indivíduos não infectados7. Por utilizar "primers" que são específicos para micobactérias do complexo tuberculosis, a PCR é capaz de, em poucas horas, definir sobre a presença ou não do patógeno na amostra e indicar a melhor terapêutica para o caso. Em condições extremas, esta técnica pode ser refinada para torná-la capaz de determinar não só a presença, mas também a sensibilidade de micobactérias aos tuberculostáticos disponíveis para o tratamento da tuberculose, além de estudos de epidemiologia molecular e tipagem de cepas em cultura12.
Quando se analisa um novo método, o desempenho do teste-padrão é um parâmetro crítico. Para a detecção do M. tuberculosis a cultura pode ser considerada o "gold standard", por ter especificidade de 100% e sensibilidade de aproximadamente 90%2. Para que a cultura de um espécime clínico seja positiva são necessárias entre 10 e 100 células de M. tuberculosis na amostra2. A PCR é capaz de detectar até uma cópia de DNA de M. tuberculosis, como já foi demonstrado por Eisenach et al4. O presente resultado mostrou um teste capaz de detectar até 3 bacilos em uma solução-padrão (dados não mostrados), o que confirma a extrema sensibilidade da técnica em amplificar seqüências genômicas do M. tuberculosis. Em amostras clínicas como o escarro, em que estão presentes várias substâncias inibidoras da PCR, o resultado também foi satisfatório, com sensibilidade de 90%. A padronização da técnica, principalmente da extração do DNA, é fundamental no sucesso do teste. Observou-se que a lavagem exaustiva do escarro descontaminado é essencial, pois elimina substâncias inibidoras da Taq DNA polimerase que poderiam gerar resultados falso-negativos, comprometendo a sensibilidade do teste5. Apesar deste cuidado, uma entre as 10 amostras com cultura positiva foi PCR negativa.
A PCR mostrou uma sensibilidade de 90% e especificidade de 81% quando comparada somente com os resultados da cultura. Dos 31 pacientes com cultura negativa, 6 apresentaram PCR positiva, o que representa uma perda de 19% na especificidade, e das 15 PCR positivas, 6 eram cultura negativa, expressa no valor preditivo positivo de 60%. Dentre os 6 pacientes com cultura negativa e PCR positiva, 2 tinham baciloscopia positiva, sendo importante esclarecer que a PCR não foi avaliada considerando essa informação, ou dados clínicos dos pacientes. Somente a cultura positiva foi critério para a definição de caso de tuberculose, o que pode ter excluído indivíduos doentes em que a cultura teve resultado negativo. Portanto, é realmente possível que entre esses 6 exames houvesse pacientes com tuberculose que não foram considerados nesta análise, pela definição restrita de caso e por não se dispor das informações clínicas. A correlação dos resultados com a apresentação clínica do paciente é crucial na avaliação do teste, pois pode-se diagnosticar tuberculose por indícios clínicos e laboratoriais quando a cultura está negativa e confirmar a hipótese após prova terapêutica. O maior número de PCR positivas do que culturas com crescimento de M. tuberculosis pode ser decorrente também da limitação intrínseca do cultivo, que tem uma sensibilidade em teoria menor que a da PCR. Outra limitação observada, quando se avaliou o teste apenas considerando o resultado microbiológico convencional, é a possibilidade de contaminação da cultura com bactérias ou fungos, como aconteceu em uma amostra do presente estudo, levando ao descarte da mesma. O tratamento da amostra para descontaminação, com hidróxido de sódio, pode inativar o M. tuberculosis e resultar em cultura falso-negativa. Por outro lado, a PCR pode detectar a presença do DNA e não a viabilidade do bacilo, podendo amplificar material genético de microorganismos mortos ou "latentes", gerando resultado de PCR falso-positivo. Uma extensão da presente pesquisa está sendo desenvolvida com maior número de amostras, analisando a PCR contra resultados microbiológicos e informações clínicas, para avaliar a amplitude das limitações citadas acima e a real importância da PCR no diagnóstico da tuberculose pulmonar no Brasil.
Por ter grande potencial como ferramenta de alta sensibilidade e especificidade, além da rapidez no diagnóstico laboratorial da tuberculose, vários grupos têm desenvolvido esta tecnologia, inclusive com desenvolvimento de "kits" comerciais, o que torna o teste muito caro3. Apesar disso, PCR "in house" é factível considerando o custo de uma internação de um paciente com tuberculose, aguardando o diagnóstico definitivo, ou sua presença no ambiente familiar e social com alto risco de transmissão que essa doença possui. O grande impacto na prevenção da disseminação da tuberculose deve-se a instituição do tratamento específico, o mais precocemente possível. Para não se iniciar, empiricamente, tratamento que tem conhecidos efeitos colaterais e longa duração, o diagnóstico precoce é de fundamental importância, tanto do aspecto individual como de saúde pública. O desenvolvimento e padronização própria para o teste torna seu custo mais acessível, tendo em vista que esta tecnologia deve ser reservada para centro de referência em diagnóstico e tratamento da tuberculose.
O presente trabalho é um dos primeiros de investigação do uso da PCR no Brasil, que apesar das condições de saúde pública menos favoráveis quando comparado aos países desenvolvidos, deve avaliar o uso rotineiro da PCR. Certamente a PCR terá muita importância no diagnóstico da tuberculose no Brasil, quando usada com critério e em centros de referência para o tratamento da tuberculose. Não se acredita que a PCR possa substituir ou superar plenamente as ferramentas diagnósticas atualmente disponíveis para a confirmação da tuberculose. O exame clínico cuidadoso, o estudo radiográfico, a baciloscopia e a cultura às vezes são insuficientes para a definição-diagnóstica. A disponibilidade de uma ferramenta potente como a PCR será de grande utilidade para essa definição com maior precisão e precoce instituição terapêutica.
No entanto, como ressaltam Kritski et al.10, antes que tais exames se incorporem à rotina-diagnóstica, deve-se realizar estudos controlados para padronizar e avaliar as técnicas de biologia molecular no Brasil, com pacientes locais, considerando que a prevalência de tuberculose sempre foi muito elevada e agora também a co-infecção AIDS-TB tem sido diagnosticada com alta freqüência no Brasil.
REFERÊNCIAS
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Correspondência para/Correspondence to:
Benedito A. L. da Fonseca
Av. Bandeirantes, 3900 - Monte Alegre 14049-900 Ribeirão Preto, SP - Brasil
E-mail: baldfons@fmrp.usp.br
Edição subvencionada pela FAPESP (Processo nº 98/13915-5).
Recebido em 2.6.1998. Reapresentado em 13.10.1998. Aprovado em 1.12.1998.
* Apresentado nos Anais do VIII Congresso Panamericano e X Congresso Brasileiro de Infectologia, Salvador, Bahia, 1997.