COMUNICAÇÕES / COMMUNICATIONS

 

Seqüenciamento e variabilidade do fragmento genômico de Xylella fastidiosa amplificado pelos iniciadores RST31/33*

 

Sequencing and variability of the Xylella fastidosa - specific genomic fragment amplified by the primer pair RST 31/33

 

 

Adriane Wendland^I,**; Daniela Truffi^I; Rui P. Leite Júnior^II; Luis E. A. Camargo^I

^IDepartamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola, Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo, Cx. Postal 9, CEP 13418-900, Piracicaba, SP, Fax: (19) 434-4839, e-mail: leacamar@carpa.ciagri.usp.br
^IIÁrea de Proteção de Plantas, Instituto Agronômico do Paraná, Cx. Postal 481, CEP 86001-970, Londrina,PR

 

 

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RESUMO

Xylella fastidiosa é agente causal de diversas doenças de importância econômica como a clorose variegada dos citros (Citrus spp.) (CVC), mal de Pierce da videira (Vitis vinifera), escaldadura da ameixeira (Prunus salicina) e requeima do cafeeiro (Coffea arabica). A seqüência nucleotídica do fragmento genômico, específico de X. fastidiosa, amplificado pelo par de iniciadores RST31/33 foi determinada para 38 isolados de citros e para isolados de videira, cafeeiro e ameixeira objetivando avaliar o nível de polimorfismo entre isolados e a identidade genômica do fragmento. Não foi observado polimorfismo de seqüência nucleotídica entre isolados de citros, mas foi detectado polimorfismo entre isolados de citros e de videira, cafeeiro e ameixeira. A presença do sítio de clivagem RsaI, que distingue isolados de citros e videira de isolados de ameixeira e outras espécies arbóreas, foi identificada em um isolado de ameixeira proveniente dos EUA mas não em outro proveniente do Brasil.

Palavras-chave adicionais: CVC, polimorfismo de seqüência, seqüenciamento, genes rpoD.

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ABSTRACT

Xylella fastidiosa causes several plant diseases of economic importance such as citrus (Citrus spp.) variegated chlorosis (CVC), Pierce's disease of grapevine (Vitis vinifera) and leaf scorch of plum (Prunus salicina) and coffee (Coffea arabica). The nucleotide sequence of the genomic fragment, specific to Xylella fastidosa, amplified by the pair of primers RST 31/33, was determined for 38 isolates from citrus and for isolates from grapevine, coffee and plum in order to assess the level of sequence polymorphism of this fragment among isolates, as well as its genomic identity. Sequence polymorphism was not observed among isolates from citrus, but was detected among isolates from citrus and from grapevine, coffee and plum. The presence of a RsaI restriction site, which distinguishes isolates from citrus and grapevine from plum and other arboreal species, was identified in a North American isolate from plum but not in a Brazilian one.

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A clorose variegada dos citros (Citrus spp.) (CVC) é uma doença de grande importância econômica para a citricultura brasileira devido à redução na produção e qualidade dos frutos (Laranjeira & Palazzo, 1999). A CVC é causada pela Xylella fastidiosa, bactéria limitada ao xilema, fastidiosa, Gram-negativa, não-móvel, aflagelada, baciliforme, com parede celular enrugada e estritamente aeróbia (Wells et al, 1987). Detectada pela primeira vez em 1987 no Norte do Estado de São Paulo e no Triângulo Mineiro (Rossetti & De Negri, 1990), a doença foi observada em todas as regiões citrícolas do Brasil.

Este patógeno também é responsável por doenças em diversas culturas, como Mal de Pierce em videira (Vitis vinifera L.), "phony peach" em pessegueiro [Prunus persicae (L.) Batsch], escaldadura das folhas em ameixeira (Prunus salicina Lindl) (Wells et al, 1987) e cafeeiro (Coffea arabica L.) (Paradela et al., 1995; Beretta et al., 1996) e outros hospedeiros que englobam espécies de pelo menos 28 famílias de plantas mono e dicotiledôneas (Freitag, 1951; Wells et al., 1987; Hopkins, 1989).

Seqüências de DNA específicas têm sido utilizadas para detecção de X. fastidiosa por reação de polimerase em cadeia (PCR) em material vegetal (Minsavage et al., 1994, Pooler & Hartung, 1995, Beretta et al., 1997). O par de iniciadores RST 31/33, por exemplo, produz um fragmento de 733 pb específico para X. fastidiosa e tem sido utilizado rotineiramente em exames diagnósticos dessa bactéria Minsavage et al., 1994). No entanto, a seqüência completa deste fragmento é, até o momento, desconhecida. Segundo os autores, a existência de um sítio de restrição RsaI neste fragmento possibilita distinguir isolados de citros e videira de isolados de ameixeira e outras espécies arbóreas. Assim, este trabalho objetivou determinar a seqüência deste fragmento e avaliar o nível de polimorfismo de seqüência encontrado entre isolados de citros, videira, ameixeira e cafeeiro.

Coleção de isolados de Xylella fastidiosa

Folhas de laranjeira (Citrus sinensis L.) 'Pêra' com sintomas de CVC foram coletadas em pomares localizados nas regiões citrícolas do Noroeste (Neves Paulista), Centro (Gavião Peixoto) e Sul (Santa Rita do Passa Quatro) do Estado de São Paulo. O isolamento de X. fastidiosa foi realizado de acordo com a metodologia descrita por Hill & Purcell (1995). Placas contendo meio PWG (Hill & Purcell, 1995) foram mantidas a 28 ± 1 ºC até o surgimento das colônias bacterianas. Após o crescimento, foi realizada a purificação dos isolados através da retirada de uma colônia individual para cada isolado com auxílio de alça de platina e distribuição em nova placa contendo meio PWG. Os isolados foram conservados em criotubos contendo meio PW e 30% glicerol e armazenados a -70 ºC. Isolados de cafeeiro, videira e ameixeira (Tabela 1) pertencentes à Coleção Bacteriológica da Área de Proteção de Plantas do Instituto Agronômico do Paraná estavam armazenados a -70 ºC e foram recuperados em placas contendo meio PWG.

 

 

Obtenção de DNA genômico de Xylella fastidiosa

A extração do DNA genômico dos isolados de citros e de outros hospedeiros foi realizada conforme descrito por Ausubel et al. (1992) e a sua concentração foi determinada com fluorômetro DyNA 200 (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA, EUA).

Confirmação da identidade dos isolados

A amplificação do DNA por PCR para confirmação da identidade dos isolados de X. fastidiosa (Minsavage, 1994) foi realizada em reações de 25 ml contendo tampão de amplificação (1X), 100 mM de cada dNTP, 50 mM dos iniciadores RST31 (5'-GCG TTA ATT TTC GAA GTG ATT CGA TTG C-3') e RST33 (5'-CAC CAT TCG TAT CCC GGT G- 3'), 1,25 U Taq DNA polimerase e 3 ml de DNA (aproximadamente 30-50 ng). A amplificação por PCR foi realizada em termociclador PTC 100 (MJ Research, Alameda, CA, EUA), inicializada com desnaturação a 95 ºC por 1 min seguida de 40 ciclos de desnaturação a 95 ºC por 30 s, anelamento a 55 ºC por 30 s e extensão a 72 ºC por 45 s. A extensão final foi realizada a 72 ºC por 5 min. Os produtos amplificados foram resolvidos por eletroforese em gel de agarose (1%) contendo brometo de etídio (0,5 mg/ml de gel) à 5V/cm. O peso molecular foi comparado ao padrão 1 Kb (Pharmacia. San Francisco, CA, EUA) e o gel foi fotografado após a corrida com fotodocumentador ImageMaster VDS (Pharmacia Biotech, San Francisco, CA, EUA) sob luz UV.

Avaliação da freqüência de polimorfismo de seqüência da região amplificada pelos iniciadores RST31 e RST33

O seqüenciamento dos fragmentos amplificados pelos iniciadores RST31/RST33 foi feito por meio de PCR utilizando o kit Big Dye Terminator (Perkin Elmer, Norwalk, CT, EUA). Os fragmentos foram previamente retirados do gel de agarose de baixo ponto de fusão (Promega, Madison, WI, EUA) e purificados por meio do kit Wizard® PCR Preps DNA Purification System (Promega). Para cada reação foi preparada uma mistura contendo 8 ml de TRR mix (terminator ready reaction mix), 3,2 pmol do iniciador RST31 para o sentido anverso ou 3,2 pmol do iniciador RST33 para o sentido reverso, 2,5 ml do produto previamente amplificado contendo aproximadamente 30-50 ng de DNA e 8,5 ml de água. A amplificação para seqüenciamento foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (PE Applied Biosystems, Norwalk, CT, EUA). Foi feita nova purificação do produto amplificado por precipitação com isopropanol em microtubos. Após a desnaturação das amostras a 95 ºC por 3 min foi realizada eletroforese em aparelho ABI Prism 377 DNA SequencerÔ (PE Applied Biosystem, Norwalk, CT,EUA)

As seqüências foram alinhadas e comparadas com auxílio do software SequencherÔ 3.0 (Gene Code Corporation, Michigan, EUA) com a finalidade de identificar polimorfismo nas seqüências nucleotídicas. A seqüência dos isolados de X. fastidiosa de citros foi comparada às seqüências de outras espécies bacterianas depositadas em banco de dados para identificação de homologia.

A amplificação por PCR do DNA dos isolados de X. fastidiosa realizada com os iniciadores RST31/RST33 foi positiva para todas as amostras testadas (dados não apresentados). A seqüência consenso parcial de 587 pb foi obtida através da sobreposição e alinhamento da seqüência de cada um dos isolados em ambos os sentidos. Entre os 38 isolados de citros incluídos neste estudo, não foi observado polimorfismo de seqüência nucleotídica.

As seqüências dos isolados de videira e ameixeira apresentaram polimorfismo quando comparadas às seqüências dos isolados de citros (Tabela 2): os isolados 8935 e 9715 de videira apresentaram um total de sete e três bases distintas, respectivamente; os isolados de ameixeira 9777 (EUA) e 12304 (Brasil) apresentaram polimorfismo (de 8 a 6) em relação aos isolados de citros, mas também apresentaram quatro bases diferentes entre si. O isolado 11782 de cafeeiro apresentou apenas uma única base que o distinguiu dos isolados de citros. Os demais isolados de cafeeiro incluídos neste estudo apresentaram seqüência idêntica à dos isolados de citros.

 

 

Minsavage et al. (1994) observaram que a digestão do fragmento RST31/33 com enzima de restrição RsaI gerou produtos que permitiram diferenciar os isolados em dois grupos distintos de X. fastidiosa: um grupo correspondente a isolados do mal de Pierce e CVC, cujo fragmento não foi digerido pela enzima, e um outro grupo que inclui isolados de ameixeira e espécies arbóreas, onde a digestão resultou em dois fragmentos de aproximadamente 600 pb e 100 pb. Os resultados obtidos a partir do seqüenciamento do fragmento RST31/33 demonstraram que o isolado 9777 de ameixeira procedente dos EUA apresenta o sítio de clivagem RsaI (GTAC/CATG) na posição 87 (Tabela 2). Por outro lado, em isolados de citros e videira esse sítio não foi identificado, concordando com os resultados obtidos pelos referidos autores. O isolado 12304 de ameixeira procedente do Brasil, ao contrário, não apresentou o sítio de clivagem RsaI, indicando a existência de variabilidade genética entre isolados deste hospedeiro, a necessidade de se avaliar mais isolados de ameixeira do Brasil para compará-los a outros grupos e que a ausência/presença deste sítio não é um bom indicador para agrupar isolados segundo os hospedeiros em que foram coletados. Costa et al. (2000), observaram, também, diferenças entre isolados de ameixeira provenientes dos EUA e Brasil devido ao seu agrupamento com isolados de outros hospedeiros do seu respectivo país de origem.

Embora os isolados de citros e videira sejam considerados do mesmo grupo por Minsavage et al. (1994), devido ao perfil eletroforético semelhante após digestão de DNA com a enzima de restrição RsaI, estudos recentes de variabilidade genética de X. fastidiosa evidenciam a sua separação em grupos distintos. Pooler & Hartung (1995) por exemplo, descrevem uma região específica com inserção de 28 nucleotídeos encontrada no genoma de isolados de citros diferenciando-os de isolados de videira. Leite Jr. et al. (1998) diferenciaram isolados de citros e videira com base na sua similaride genética obtida por eletroforese de campo pulsado com as endonucleases Not I e Sfi I. Os resultados do presente trabalho estão de acordo com estes dois últimos relatos pois, embora tenha demonstrado a ausência de polimorfismo no sítio de restrição de Rsa I entre isolados de videira e de citros, demonstrou a existência de polimorfismos entre isolados destes hospedeiros em outras regiões da seqüência analisada. Assim, um estudo abrangendo mais isolados de cada hospedeiro pode resultar na identificação de outros sítios de restrição que distinguam isolados destes dois hospedeiros.

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Aceito para publicação em 13/11/2001

 

 

Autor para correspondência: Luis E. A. Camargo
* Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor. ESALQ/USP
** Bolsista da FAPESP