AÇÃO DA INSULINA NA MORFOGÊNESE DE EMBRIÕES DE Gallus gallus domesticus

 

DIAS, P. F. E MÜLLER, Y. M. R.

 

Laboratório de Embriologia, Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa Catarina, Campus Universitário Trindade, CEP 88040-900, Florianópolis, SC

Correspondência para: Paulo Fernando Dias, Laboratório de Embriologia, Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa Catarina, Campus Universitário Trindade, CEP 88040-900, Florianópolis, SC

Recebido em 11/08/97 - Aceito em 23/06/98 - Distribuído em 30/06/99

(Com 2 figuras)

 

 

ABSTRACT

The action of insulin in the morphogenesis of chick embryos

Aspects concerned with morphogenesis of Gallus gallus domesticus, avail studies related to the action of the insulin in the topography and embryonic structures. At the temperature of 37.5ºC, eggs were incubated during 24 h, injected with 5 ml of swine insulin in three concentrations and reincubated for more 72 h. The morphological characteristics of 80 embryos were evaluated and, according to the presented organization, classified in 5 morphogenetic levels. It was registered generalized dismorphism (4th level) in 21 embryos that went through the tests with insulin. Standard morphogenesis (1st level) and located dismorphism (3rd level) were verified among those from the control experiments. Those individuous concerned with the 4th level, showed reduced dimension of the body and were characterized by anterior-dorsal limits organized in a cephalic projection, and also presented alterations in the posterior-ventral region. These features evidence a pattern of abnormality in the determination of the cephalic-caudal axis and indicate a specific action of the insulin in the embryonic morphogenesis, in the period of 96 hours of incubation.

Key words: insulin, chick embryos, morphogenetic levels.

 

RESUMO

Aspectos concernentes à morfogênese de Gallus gallus domesticus viabilizam estudos relacionados à ação da insulina sobre estruturas e topografia embrionárias. Na temperatura de 37,5ºC, ovos foram incubados por 24 h, injetados com 5 ml de insulina de suínos em 3 concentrações e reincubados por mais 72 h. As características morfológicas de 80 embriões foram avaliadas e, de acordo com a organização apresentada, classificados em 5 níveis de morfogênese. Em 21 embriões submetidos aos testes com a insulina registrou-se dismorfismo generalizado (4^o nível), enquanto nos de experimento de controle foi verificado morfogênese-padrão (1^o nível) e dismorfismo localizado (3^o nível). Aqueles espécimes mostraram corpo com dimensões reduzidas, caracterizado por limites ântero-dorsal organizados em uma projeção cefálica e regiões posterior-ventral alteradas, evidenciando um padrão de anormalidades na determinação do eixo ântero-posterior, que indica a ação específica da insulina na morfogênese embrionária no período de 96 horas de incubação.

Palavras-chave: insulina, embriões de Gallus gallus, níveis morfogenéticos.

 

 

INTRODUÇÃO

A embriogênese envolve uma diversidade de comportamentos teciduais, processados por fatores intrísecos e extrínsecos, em que sinais e receptores celulares participam dos eventos que modelam progressivamente o organismo, resultando, normalmente, na organização da forma-padrão (Eyal-Giladi et al., 1992; Jacobson, 1993; Ekblom, 1995; Moury & Schoenwolf, 1995; Gumbiner, 1996; Fleming et al., 1997).

A complexidade crescente dos processos e a relação tempo-espaço no desenvolvimento possibilitam uma cronologia da ontogênese, na qual a partir da forma normal ou de seu comprometimento, torna-se viável o estabelecimento de níveis de morfogênese (Hamburger & Hamilton, 1951; Duboule, 1994; Schoenwolf, 1994).

Em Gallus gallus domesticus, até o final do 4^o dia de incubação estão estabelecidos os primórdios da topografia embrionária, em que sinais reguladores se fazem presentes, constituindo um campo para a ação de substâncias que, a exemplo da insulina, compõem o sistema de indução evolutivamente conservado. Nessa espécie, a insulina está presente no 2^o dia de incubação e age ligando-se a receptor específico na superfície celular, com subunidades de domínios extracelular, transmembranal e intracelular (Eyal-Giladi, 1991; Raw et al., 1991; De Pablo et al., 1982; Cheathan & Kahn, 1995; Christ & Ordahl, 1995; Schoenwolf & Yuan, 1995).

Os efeitos pleiotrópicos no metabolismo e no crescimento do organismo indicam que, a partir de sua ligação com o receptor, a insulina ativa inúmeras vias de transdução do sinal, na maioria das vezes transmitido por ativação seqüencial de proteínas quinases, as quais, a exemplo das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK), formam complexos de ativação entre si ou com outras proteínas e enzimas (Pennington et al., 1995; Tsakiridis et al., 1995; Jonas et al., 1997).

A amplificação do sinal, em cadeia de reações multidirecionais, é modulada por moléculas reguladoras citosólicas e nucleares que estimulam a fosforilação de fatores de transcrição, ativando inúmeras proteínas ligantes de DNA, estimulando o metabolismo e outras respostas celulares, com influência direta sobre o crescimento e a morfogênese (Cheathan & Kahn, 1995; León et al., 1995; Rampalli & Zelenka, 1995; Shibley & Pennington, 1995; Seger, 1996; Sadler, 1997). Segundo Jayanth et al. (1995), esses sinais mitogênicos e metabólicos regulam a expressão de pelo menos 30 genes.

Os efeitos da insulina reportados em embriões de galo de 2 a 4 dias de incubação indicaram ação estimulatória do crescimento, em doses reduzidas, e teratogênica, em altas doses. Os estudos que empregaram baixas concentrações de insulina (0,1 a 1,0 ng/ml) demonstram um aumento de até 50% no consumo de glicose na fase de discogástrula, tendo como conseqüência o estímulo no desenvolvimento (De Pablo et al., 1990; Reusch et al., 1995).

Experimentos realizados em tecidos embrionários e fetais de aves e mamíferos revelaram que a ação estimulatória em resposta à insulina é diversificada, induzindo processos de divisão celular e crescimento. Em concentrações intermediárias (100 ng/ml), a insulina estimulou, por diferentes mecanismos, a transcrição do gene para g-cristallin, induziu a diferenciação de mioblastos e células gliais, provocou reorganização da actina e o transporte de glicose (De Pablo et al., 1990; León et al., 1995; Livnat et al., 1995; Sena & Ferret-Sena, 1995; Tsakiridis et al., 1995).

Segundo Rampalli & Zelenka (1995), a insulina atua também como fator de sobrevivência, na ausência da qual explantes de células epiteliais do cristalino, de embriões de 6 dias de incubação, desencadearam apoptose.

Dosagens elevadas de insulina, da ordem de mg/embrião de galo, causaram desde a morte até o crescimento anormal, acompanhado da diminuição na concentração total de proteínas e ácidos nucléicos, bem como da redução da extremidade posterior nos embriões. Naquela condição, Pennington et al. (1995) reportaram que o tratamento com insulina exógena não estimulou o crescimento dos embriões e, quando administrado conjuntamente com álcool, produziu efeitos inibitórios.

Cole & Trasler (1980) já haviam demonstrado que a insulina, na dosagem elevada, altera significativamente o índice mitótico, o padrão de rotação e fechamento do tubo neural e o metabolismo de carboidratos em embriões de ratos, causando secundariamente uma redução no nível de glicose disponível.

O conhecimento sobre a ação de um fator só pode ser adequadamente estabelecido quando o sistema é inicialmente testado em diferentes concentrações (Rodier et al., 1994). Entretanto, após a identificação das concentrações em que ocorrem injúrias, torna-se necessário caracterizar a extensão desses efeitos. Os aspectos anteriormente abordados justificam a realização de trabalhos sobre a ação da insulina, em dosagens que elicitam uma resposta efetiva nos embriões, investigando-se níveis morfogenéticos no período de 24 a 96 horas de desenvolvimento.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Ovos fertilizados de Gallus gallus domesticus foram incubados a 37,5ºC, de acordo com Magaldi (1974) e Guadagnin (1994), e após o período preliminar de 24 horas, foi efetuada abertura na casca (1,22 cm²). Os embriões foram, então, avaliados, submetidos aos testes e retornaram à estufa por um período complementar de 72 horas.

A metodologia demonstrou que os embriões viáveis apresentavam nível de desenvolvimento definido entre o estádio de gástrula tardia e nêurula inicial (Hamburger & Hamilton, 1951). Nos testes, por meio da abertura na casca e com auxílio de um aparato estereotáxico e agulha (Æ = 0,2 mm), injetou-se no saco vitelínico subjacente ao neuroectoderma anterior um volume de 5 l de insulina de suínos (Neosulin/Biobrás) em uma das três concentrações: 0,5 U (I); 0,125 U (I1) ou 0,031 U (I2).

Estipularam-se três níveis de controle: (i) para a incubação na qual os ovos foram efetivamente mantidos intactos na incubadora por 96 horas; (m) para a manipulação em que se substituiu o procedimento de injeção por uma perfuração; e (v) para o veículo, no qual se substituiu a insulina por água destilada. Concluído o período de incubação, no mínimo 10 embriões viáveis em cada uma das 6 modalidades de experimentos foram caracterizados quanto à morfologia externa. Realizou-se o levantamento da forma-padrão ou das categorias de anormalidades presentes por indivíduo e, através de um protocolo adaptado de Bowden et al. (1993), cada registro foi classificado em um dos 5 níveis morfogenéticos, cuja escala abrange desde a categoria normal até a condição em que não se evidencia a organização céfalo-caudal (Tabela 1).

 

TABELA 1

Protocolo de avaliação da forma embrionária.

 

O nível morfogenético máximo registrado por embrião foi sumariado estatisticamente, e as diferenças entre médias foram determinadas através da ANOVA (p £ 0,05) e do método da menor diferença significativa (LSD), no sistema Statgraphics (Univ. of Illinois, EUA), versão 5,0.

 

RESULTADOS

A análise de 80 embriões após 96 horas de incubação apontou 24 indivíduos com características morfológicas normais (30%) – 1^o nível de morfogênese pertencente aos controles e, do total de 61 que apresentaram malformação, 42 (67%) correspondem a embriões injetados com insulina. Entre os indivíduos malformados foram levantadas 13 categorias de alterações na morfogênese, com possível multiplicidade num mesmo espécime, as quais foram caracterizadas entre o 2^o e o 5^o nível, de acordo com a intensidade crescente de comprometimento nos processos (Tabela 2).

 

TABELA 2

Freqüência de embriões normais e de categorias de malformação, e níveis morfogenéticos em todas as modalidades de incubação.

 

A Tabela 2 mostra que 2 categorias de alteração da forma ocorreram uma única vez e, com excessão do controle (i), as demais modalidades de incubação revelaram mais de uma categoria de alteração por indivíduo. Registrou-se, respectivamente, 1/13, 5/12 e 8/13 de alterações na forma dos embriões nos controles (i), (m) e (v).

Nos testes não foram observados indivíduos com morfogênese normal, sendo que, entre as 10 categorias de malformações, 6 resultaram comuns também nos controles (m) e (v). Foram registrados, principalmente, casos de nanismo ou atraso no desenvolvimento e conjuntos de anormalidades particulares, destacando-se, entre estes, o padrão "Sphinx-shaped" (Figs. 1b e 1c), cuja freqüência elevou-se à medida que aumentou a concentração de insulina.

 

Fig. 1 — Embriões de Gallus gallus domesticus incubados a 37,5ºC por 96 horas. (a) Embrião normal (estádio 23); controle [29 x] (b), (c). Padrão “Sphinx-Shaped”. Embriões em planos dorsal e lateral; testes com insulina (I) [86 x e 144 x].

 

Presente em 21 embriões injetados com insulina, o padrão "Sphinx-shaped" caracteriza-se por apresentar as dimensões do corpo reduzidas e a ausência de flexuras e de rotação, sendo possível reconhecer o eixo ântero-posterior pelo fato de a projeção cefálica estar organizada.

Na região posterior, há crescimento desorganizado, resultando em dismorfismo generalizado, em detrimento do eixo médio-caudal. A configuração tridimensional de uma esfinge visualizada nesses espécimes motivou a denominação utilizada para representar o padrão morfológico descrito.

As diferenças entre as médias das modalidades de incubação (i), (m), (v) e (I), (I1) e (I2), evidenciadas pela ANOVA (p £ 0,05) e o método de comparações múltiplas, resultaram significativas (Tabela 3).

 

TABELA 3

Tamanho das amostras, mediana, moda e média ± desvio-padrão, referentes ao nível morfogenético nas seis modalidades de incubação.

 

Nossos resultados (Tabela 3) evidenciam diferentes tipos de alteração generalizada na morfogênese dos indivíduos tratados com a insulina nas 3 concentrações testadas caracterizada como de 4^o nível.

Em embriões das modalidades de controle (m) e (v), o mesmo nível de morfogênese expressa apenas uma redução no ritmo de crescimento. A freqüência intermediária das anormalidades relacionadas ao 3^o nível referem-se a dismorfismo localizado, decorrente principalmente de assimetrias e malformações das regiões anterior e posterior, a exemplo da redução do botão caudal. Observaram-se espécimes com desenvolvimento padrão – 1^o nível morfogenético apenas nas 3 modalidades de controle (Fig. 1a).

 

DISCUSSÃO

Os processos de desenvolvimento da forma, organizados em níveis morfogenéticos (Tabela 1), refletem a direção e o ritmo da diferenciação dos tecidos na embriogênese. As freqüências relativamente altas de malformações nos controles (m) e (v) em relação ao controle (i) (Tabela 2) evidenciam que fatores físicos interferem na morfogênese embrionária.

Mas o seu nível de comprometimento estrutural é, em média, significativamente menor que o verificado nos testes, em que as freqüências significativas de dismorfismos generalizados (4^o nível) demonstram que, nas concentrações administradas, a insulina compromete o desenvolvimento normal, desencadeando um padrão de malformações característico (Fig. 2).

 

Fig. 2 — Freqüência de embriões de acordo com o nível morfogenético máximo, nas modalidades de incubação (i), (m), (v), (I2), (I1) e (I).

 

A presença de um padrão de anomalia específico da insulina confere a possibilidade de que esta substância esteja potencializando efeitos causados pela manipulação ou inerentes à própria dinâmica do desenvolvimento.

Os casos de nanismo e o padrão "Sphinx-shaped" permitem inferir que a insulina, nas doses utilizadas, retarda o ritmo do desenvolvimento e altera a forma do corpo dos embriões (Fig. 1), confirmando afirmações de De Pablo & Delarosa (1995) e Pennington et al. (1995) sobre a ação negativa desse agente no crescimento e na morfogênese, principalmente no segmento médio-posterior do neuroeixo. Este quadro de susceptibilidades à insulina decorre pelo fato de que, no período em que os testes foram realizados, excetuando-se as orientações cefálica e dorsal, os destinos das camadas celulares não estavam definitivamente determinados (Eyal-Giladi et al., 1992; Moury & Schoenwolf, 1995; Khaner, 1998).

Uma vez que os testes impuseram condições críticas ao desenvolvimento, admite-se que modificações nos centros indutores embrionários resultem em processos de diferenciação de tendência regionalizada em relação aos eixos corporais, principalmente nos extremos cefálico e caudal do organismo.

Cole & Trasler (1980) verificaram que o tratamento com a insulina altera significativamente o índice mitótico, o padrão de neurulação e o metabolismo de carbohidratos, contudo não influencia outros parâmetros do desenvolvimento. Nossos resultados referentes ao padrão "Sphinx-shaped" ratificam, em parte, estes dados e confirmam os reportados por De Pablo et al. (1990) e Reusch et al. (1995) quanto à dismorfogênese em embriões de aves e de ratos tratados com insulina.

De acordo com Reusch et al. (1995), a dosagem elevada de insulina exógena não causou mortes, embora tenha bloqueado movimentos e a proliferação celular no segmento posterior do neuroeixo. Para viabilizar sua atuação no sistema de sinalização, a insulina e outros fatores de crescimento possuem receptores específicos na superfície celular. Segundo Raw et al. (1991), em altas concentrações a insulina e o fator-I, semelhante à insulina (IGF-I), podem incorrer em reação cruzada, o que levaria a erros na sinalização.

A partir de sua ligação ao receptor, a insulina produz mediadores secundários, através da "âncora" – constituída por fosfatidilinositol, glicana e etanolamina, ligada à proteínas, a qual é hidrolizada por fosfolipases (PL). Quando essa reação é catalisada por PLD solúvel, além das formas fosforiladas e não- fosforiladas de inositol glicanas translocadas intracelularmente como substrato para as enzimas metabólicas, uma proteína contendo glicosilinositol é liberada no meio extracelular, sugerindo esse tipo de interferência nos mecanismos de sinalização como causa de erros de coordenação posicional na organogênese (Saltiel & Cuatrecasas, 1986; Ishihara et al., 1987; Romero et al., 1988; Low & Saltiel, 1988; Spaventi et al., 1990; Raw et al., 1991; Seger, 1996; Kume et al., 1997).

No meio intracelular, o comprometimento do mecanismo normal de sinalização está, possivelmente, associado à exacerbação de um dos setores da rede de transdução do sinal da insulina, desequilibrando a modulação seqüencial de fosforilação e desfosforilação de proteínas.

Isso poderia explicar, nas formas "Sphinx-shaped", a desorientação progressiva do eixo céfalo-caudal no segmento posterior em que a mobilização de glicose, requerida nessa etapa, produziria anormalidades no processo de crescimento.

A similaridade dos processos na topografia embrionária da ave sugere que a manutenção do modelo utilizado proverá informação adicional sobre a ação da insulina e de fatores semelhantes nos mecanismos relacionados à organização dos campos morfogenéticos.

 

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