Parasitol Latinoam 58: 3 - 10, 2003 FLAP

ARTÍCULO ORIGINAL

Variaciones biológicas de Trypanosoma cruzi
(Kinetoplastida:Trypanosomatidae) asociadas con la
ingestión de diferentes tipos de sangre por el vector
Triatoma dimidiata (Hemiptera: Reduviidae)

OLGER CALDERÓN-ARGUEDAS*, MISAEL CHINCHILLA*, FERNANDO GARCÍA* y MARIO VARGAS*

BIOLOGICAL VARIATIONS OF Trypanosoma cruzi (KINETOPLASTIDA:
TRYPANOSOMATIDAE) ASSOCIATED TO THE INGEST OF DIFFERENT KINDS OF
BLOOD BY THE VECTOR Triatoma dimidiata (HEMIPTERA: REDUVIIDAE)

The effect of avian and mouse blood in the gut of Triatoma dimidiata (Hemiptera: Reduviidae) on the biological characteristics of two costarican strains of T. cruzi (TC-2 and TC-4) was evaluated in a murine model. This relationship defined four experimental systems named TC-2 gallina, TC-2 raton, TC-4 gallina and TC-4 raton. Parasites from each system were inoculated intraperitonealy in C₃H mice and the course of the infections were observed three times a week during 60 days. The observations included parasitemia levels (parasites/mm³), concentration of slender and broad forms, duration of prepatent and patent periods, survival, and cumulated mortality. The infection characteristics in all the systems were similar with parasitemia peaks in the days 23 to 33 post infection and broad forms as the predominant tripomastigote circulating forms in all the systems. Some variables such as prepatent and patent periods did not show statistically significant differences (p < 0.05). However, the survival was prolonged in mice that were infected to parasites associated to avian blood. The evolution of the mortality was slower in these systems. The data suggests that the parasite virulence modulation could be related to the particular blood sources in the vectors.

Key words: Trypanosoma cruzi, Trypanosomatidae, Triatoma dimidiata, virulence, infections.

INTRODUCCIÓN

La modulación de la virulencia y la infectividad de Trypanosoma cruzi asociadas con los vectores han sido fenómenos documentados en la literatura científica^1-3. Dado que el parásito utiliza el lumen intestinal del insecto como ambiente de multiplicación y dife-renciación, las interacciones que T. cruzi pueda establecer con su entorno podría condicionar la variación de sus propiedades biológicas dentro de las cuales figuran la virulencia y la patogenicidad.

El tipo de sangre ingerida por los vectores puede ejercer algún efecto en los parásitos que están en procesos de multiplicación y dife-renciación propios de su ciclo de vida⁴.

Algunos estudios de carácter epidemiológico han demostrado que en las zonas donde predominan vectores con un comportamiento altamente ornitofílico, la prevalencia de la infección con T. cruzi en humanos, así como las manifestaciones clínicas de la enfermedad de Chagas tienden a ser mínimas^5,6. Esta observación plantea la posibilidad de que la sangre aviar, como un eventual sustrato de alimentación en los vectores, pueda modular las características patogénicas o de infectividad en el parásito.

Basado en estos antecedentes se decidió implementar un modelo experimental en el cual se pueda comprobar la influencia de dos tipos de sangre (aviar y murina), ingerida por los triatominos, sobre las características biológicas de dos cepas costarricenses de T. cruzi.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se usaron dos cepas costarricenses de T. cruzi, denominadas arbitrariamente TC-2 y TC-4, las cuales se mantienen en el Departamento de Parasitología de la Universidad de Costa Rica mediante pasajes sanguíneos en ratones C₃H.

Se trabajó con ratones (Mus musculus) machos de la cepa C₃H con un peso de 18-20 g, los cuales fueron mantenidos en grupos de 5 dentro de cajas plásticas de 28 x 16 x 12 cm con agua y alimento "ad libitum" y bajo un fotoperíodo de aproximadamente 12 horas.

Se usaron ninfas de 3º y 4º estadio de Triatoma dimidiata obtenidas de la colonia que se mantiene en el Departamento de Parasitología de nuestra Facultad. Dichos insectos tuvieron un ayuno de aproximadamente cinco semanas, al momento de inicio del experimento.

Ensayo de interacción parásito-sangre aviar: Se infectaron 30 triatominos con la cepa TC-2 y un número igual con la TC-4 de T. cruzi. Dicha infección se realizó mediante alimentación por 90 minutos en ratones que mostraban parasitemias del orden de 10³ - 10⁴ formas sanguíneas/mm³ (FS/mm³).

De los triatominos infectados con cada una de las cepas, 15 fueron alimentados con sangre de gallina y 15 con sangre de ratón, lo que definió, en concordancia con las cepas utilizadas, cuatro sistemas experimentales denominados TC-2 gallina, TC-2 ratón, TC-4 gallina y TC-4 ratón. Las alimentaciones se efectuaron en los días 30 y 60 post infección.

Transcurridos 90 días, los insectos que no murieron y a los cuales se les confirmó la infección con T. cruzi mediante observación microscópica de las heces (Tabla 1), se disecaron para separar el tubo digestivo y transferirlo a placas Petri de 35 mm de diámetro. El contenido intestinal fue suspendido y emulsificado en 2,0 mL de solución salina estéril al 0,85% y pH 7,0 con antibióticos (penicilina 100 UI/mL y estreptomicina 100 mg/mL). Las formas de T. cruzi presentes en la suspensión fueron cuantificadas en un hemo-citómetro de Neubauer.

Se ajustó, a partir de cada una de las suspensiones, un inóculo promedio de 7,6 x 10² tripo-mastigotos metacíclicos, el cual fue inyectado intraperitonealmente en cada ratón.

Los ratones fueron sangrados tres veces por semana y la parasitemia fue cuantificada por hemocitometría. Adicionalmente, para cada ratón se preparó un frotis de sangre el cual se fijó con metanol por 5 minutos y se tiñó con Giemsa para su observación microscópica en la cual se determinó la proporción de formas gruesas ("broad forms") y formas delgadas ("slender forms") del parásito. Estas fueron expresadas como formas/50 campos 40X. Las observaciones realizadas incluyeron, además, los períodos prepatente y patente, la supervivencia y la mortalidad acumulada durante un período de observación de 60 días.

Los promedios de los períodos prepatente, patente y la supervivencia de los sistemas correspondientes a cada cepa fueron comparadas mediante pruebas de T Student utilizando un nivel de significancia del 95%⁷. La mortalidad acumulada que se observó en los sistemas relativos a cada cepa fue evaluada mediante pruebas de hipótesis para la comparación de proporciones muestrales, utilizando un nivel de significación del 90%⁷.

RESULTADOS

Las infecciones por T. cruzi observadas en los ratones correspondientes a los sistemas en estudio tuvieron importantes similitudes. Las carac-terísticas relativas al tropismo tisular observado han sido publicadas con anterioridad⁸.

En los cuatro sistemas, la evolución de la parasitemia tuvo un comportamiento creciente, cuyos niveles máximos se alcanzaron entre los días 23 y 33 (Figuras 1- 4, Tabla 2). Cabe destacar que en los sistemas relacionados con sangre murina, la parasitemia máxima se alcanzó precozmente (Figuras 2 y 4). Por otro lado, la dispersión de los valores fue más marcada en los sistemas vinculados con la sangre aviar (Figuras 1 y 3).

Tanto con la cepa TC-2 como con la TC-4, se pudo observar un marcado predominio de las formas gruesas, independiente de su eventual relación con el tipo de sangre utilizado como sustrato para los triatominos (Figuras 5-8). Con respecto a los períodos prepatentes, éstos tuvieron dura-ciones de entre 13,0 a 14,1 días, sin que se pudieran evidenciar diferen-cias significativas entre los sistemas (Tabla 2).

La duración de los períodos patentes fue de 18,1 a 29,4 días sin que existieran diferencias signi-ficativas entre los sistemas relativos a cada cepa (Tabla 2). Cabe destacar que la mayoría de los ratones murieron en la fase aguda de la infección, sin que haya ocurrido la negativización de la parasitemia.

La supervivencia promedio se vio prolongada en los sistemas rela-cionados con sangre aviar (Tabla 2). Tanto en la cepa TC-2 como en la TC-4, los sistemas aviares tuvieron períodos de supervivencia signi-ficativamente mayores que los sistemas murinos (p < 0,05) (Tabla 2).

La mortalidad progresó de una manera más marcada en los sistemas relacionados con sangre murina (Figuras 9 y 10). En la cepa TC-2 se dieron diferencias que fueron significativas entre los sistemas TC-2 gallina y TC-2 ratón en los días 30, 33 y 35 post infección (p < 0,1) y para el día 40, se alcanzó la mortalidad total de los ratones del sistema TC-2 ratón. En relación con la cepa TC-4, las diferencias significativas se evidenciaron únicamente en el día 33 (p < 0,1).

Es importante mencionar que tanto en el sistema TC-2 gallina como en el TC-4 gallina, nunca se alcanzó el 100% de mortalidad.

DISCUSIÓN

El hecho de que las aves sean refractarias a la infección por T. cruzi^9-11, más las observaciones epidemiológicas en las cuales un comportamiento ornitofílico en vectores se ha relacionado con el bajo impacto de la enfermedad de Chagas en poblaciones humanas^5,6 justifica la posibilidad de considerar a la sangre aviar como un agente modulador del comportamiento parasitario.

A diferencia de las aseveraciones hechas por algunos investigadores⁴, el presente modelo permitió demos-trar que la alimentación de los triatominos infectados con sangre de ave no produce una depuración de las infecciones acarreadas por los invertebrados, por lo menos en el período que comprendió el ensayo de interacción.

A pesar de que la presencia de sangre aviar o murina en el intestino del vector podría representar una fuente de variación en las condiciones de multiplicación y diferenciación para los parásitos, las características de las infecciones generadas en los ratones tuvieron importantes similitudes. Dentro de estas figuran las características de las curvas de parasitemia (Figuras 1 - 4, Tabla 2), el tipo de formas sanguí-neas predominantes (Figuras 5 - 8) y la duración de los períodos prepa-tente y patente (Tabla 2), lo que permitió visualizar cierta estabilidad en las características biológicas de las cepas estudiadas. No obstante, se pudo observar que los períodos de supervivencia fueron significativa-mente mayores en los ratones vinculados con la sangre aviar (p < 0,05) (Tabla 2), presentándose además una evolución menos marcada de la mortalidad acumulada (Figuras 9, 10). El análisis histopatológico de estos ratones, el cual fue informado previamente⁸ permitió la observación de un menor número de nidos chagásicos por unidad de área así como infiltrados inflamatorios menos severos, lo que podría indicar una menor activación de fenómenos fisiopatológicos asociados con la infección por T. cruzi.

Diversas investigaciones han demostrado que el comportamiento de T. cruzi puede ser modulable, algunas veces perdiendo su identidad isoenzimática y sus propiedades biológicas. Este es el caso de la cepa Y, la cual puede perder sus carac-terísticas de Zymodeme A para convertirse en Zymodemes B y C cuando se le cultiva en medios con cantidades decrecientes de suero fetal, desde un 10% hasta un 5%¹². Este comportamiento puede ser revertido cuando se realiza una inoculación de los parásitos en un ratón lactante¹². Así, investigadores encontraron que al pasar por Triatoma infestans dos cepas altamente patógenas de T. cruzi (RA y UP), presentaban una disminución en sus características de virulencia e infectividad¹³. También trabajaron con una cepa poco virulenta denominada CA-I, en la cual se pudo observar un incremento en sus propiedades de virulencia y patogenicidad.

Otros experimentos han mostrado la influencia positiva de componentes del vector como la hemolinfa o extractos de órganos y tejidos en los procesos de multiplicación y diferenciación de T. cruzi en sistemas "in vitro"^14,15. Los aspectos anteriormente señalados demuestran que componentes inherentes al hospe-dador invertebrado pueden relacionarse con las características que expresan los parásitos.

Los mecanismos por los cuales los componentes anteriormente mencionados puedan ejercer sus influencia sobre las características de los parásitos no se conocen; sin embargo, evidencias señalan la posibilidad de que ocurran fenómenos de selección en los cuales clones más o menos virulentos se constituyan como los dominantes en una cepa y los cuales condicionarían el comportamiento del parásito en el hospedador^3,16.

Diversos estudios han demostrado la presencia de factores potencialmente selectivos en el lumen intestinal de los triatominos. En Rhodnius prolixus se ha descrito la presencia de un factor hemolítico, el cual es capaz de lisar con diferentes cinéticas de lisis a cepas y clones particulares de T. cruzi¹⁷, lo que demuestra la posibilidad de que existan parásitos que sean depurados más rápidamente que otros. Otro tipo de sustancias que podrían interactuar con los parásitos son las lectinas¹⁸. En relación con lo anterior se ha demostrado, mediante experimentos en cultivos celulares¹⁹, que cuando los parásitos son expuestos a diferentes tipos de monosacáridos, previo a un ensayo de infección celular, éstos muestran variaciones en sus propiedades de infectividad. Estos componentes, de tipo endógeno, podrían potenciarse o neutralizarse por agentes exógenos, donde la la sangre presente en el intestino de los vectores podría figurar como un agente selectivo.

A pesar de que los mecanismos de resistencia de las aves han sido ampliamente estudiados y caracterizados^9-11, no se puede asegurar de que éstos mismos sean los responsables de los efectos observados en el experimento, por cuanto los componentes humorales como el complemento y las gama globulinas, serían degradados por los componentes digestivos propios del intestino de los triatominos.

Queda pendiente el estudio de potenciales metabolitos resistentes a la degradación enzimáticos o productos de la misma que puedan interactuar y de esta manera mediar una eventual selección clonal que pueda ser el responsable de las modulaciones en las características observadas.

RESUMEN

El efecto de las sangres aviar y murina sobre las características biológicas de dos cepas costa-rricenses de T. cruzi (TC-2 y TC-4) fue evaluado mediante un modelo experimental en el cual se infectaron ratones con parásitos previamente expuestos a estos tipos de sangre en el intestino del vector Triatoma dimidiata (Hemiptera: Reduviidae). La relación que se estableció entre las cepas y los tipos de sangre utilizados permitió definir cuatro sistemas experimentales denomi-nados arbitrariamente TC-2 gallina, TC-ratón, TC-4 gallina y TC-4 ratón.

Parásitos de cada sistema fueron inoculados intraperitonealmente en ratones C₃H y el progreso de la infección fue registrado tres veces por semana durante un período de 60 días. Las observaciones incluyeron: niveles de parasitemia (parásitos/mm³), concentración de formas gruesas y delgadas, duración de los períodos prepatente, patente y de supervivencia y la mortalidad acumulada.

Las características de las infecciones en todos los sistemas fueron similares. Estas mostraron picos de parasitemia entre los días 23 y 33 post infección y las formas gruesas fueron los tripomastigotos san-guíneos predominantes. Algunas variables como los períodos prepatente y patente no mostraron diferencias es significativas (p > 0,05).

Sin embargo, el período de supervivencia se vio significa-tivamente prolongado en los ratones infectados con parásitos asociados a sangre aviar (p < 0,05). La evolución de la mortalidad fue menos marcada en estos sistemas.

Los datos sugieren la ocurrencia de una modulación en las virulencia parasitaria que podría estar relacionada con el tipo de sangre presente en el insecto vector.

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Agradecimientos: Los autores quieren expresar su agradecimiento a los señores Iván Coronado y Eddy Camacho por su labor asistencial y a la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad de Costa Rica por su apoyo financiero al proyecto VI- 803-097-251.

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* Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales (CIET,) y Departamento de Parasitología. Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica.