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Medicina (Buenos Aires) - Daño renal en ratas inducido por veneno de Bothrops neuwiedii diporus de Argentina

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Medicina (Buenos Aires)

versión On-line ISSN 1669-9106

Medicina (B. Aires) v.64 n.4 Buenos Aires jul./ago. 2004

 

Daño renal en ratas inducido por veneno de Bothrops neuwiedii diporus de Argentina

Patricia Koscinczuk1, Juan T. Borda1, Silvana Maruñak1, Ofelia Acosta de Perez1, Norma Mussart DE Coppo1.

1 Cátedra de Patología Médica, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Nordeste, Corrientes

Dirección postal: Dra. Patricia Koscinczuk, Cátedra de Patología Médica, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del  Nordeste, Sgto Cabral 2139, 3400 Corrientes, Argentina. Fax (54-3783)425753. E-mail: pkoscinczuk@vet.unne.edu.ar

Resumen
La insuficiencia renal aguda es una de las complicaciones sistémicas más frecuentes después de un accidente ofídico. En este estudio se evalúan los efectos que el veneno de Bothrops neuwiedii diporus produce en el riñón de ratas machos de la cepa Wistar. La histopatología permitió comprobar el desarrollo de necrosis tubular aguda; las lesiones iniciales se observaron a las 3 horas de la inoculación de una dosis de 700 µg del veneno, observándose en corteza renal congestión y degeneración  granulohialina de las células epiteliales tubulares, acompañadas de dilatación y cilindros hialinos en la luz tubular. A las 24 horas se presentó necrosis tubular aguda en una superficie extensa de la corteza sin daño de la membrana basal tubular. Las lesiones de degeneración turbia de células epiteliales tubulares, dilatación de la luz  tubular y cilindros hialinos se mantuvieron presentes hasta las 4 semanas post-inoculación. Si bien los parámetros de la bioquímica clínica asociados con insuficiencia renal aguda aumentaron  a las 6 horas de la administración del veneno (urea: 1.10±0.22 g/dl; creatinina: 19.60±1.51mg/dl), a la semana descendieron a valores normales. Las densidades urinarias, en cambio, a la semana se mantuvieron más bajas que lo normal, 1.005 ± 0.001 (p<0.001) y al mes oscilaron entre 1.005 y 1.060 (p<0.001). El daño renal producido por el veneno de B. neuwiedii diporus pudo ser valorado mejor histopatológicamente que por las técnicas convencionales de laboratorio.

Palabras clave: Bothrops neuwiedii diporus; Riñón; Víboras; Envenenamiento; Venenos.

Abstract
Renal injury in rats poisoned by venom of Bothrops neuwiedii diporus from Argentina. Acute renal failure is one of the systemic complications that can be found in bothropic accidents. In this study the effects on male Wistar rats induced by the venom of Bothrops neuwiedii diporus were evaluated. The histopathology revealed acute tubular necrosis, lesions firstly were observed 3 hours post inoculation of  700 µg of venom. Cortical kidney congestion and granulohialin degeneration of tubular epithelial cells were observed, these lesions achieved a maximum at 24 hours after inoculation. Tubular epithelial hidropic degeneration and dilatation of tubular lumen with hyalin casts were present inclusive up to 4 weeks after inoculation. Biochemical parameter values associated with kidney renal failure were increased 6 hours after venom inoculation (urea: 1.10± 0.22 g/dl; creatinine: 19.60±1.51 mg/dl), but at the end of the first week they decreased till normal values. The urinary density was lower than normal value: 1.005±0.001 (p<0.001) and at the end of the first month they oscillated between 1.005 and 1.060 (p<0.001). Renal injury induced by B. neuwiedii diporus  could be better appreciated by histopathology than by the routine laboratory assays.

Key words: Bothrops neuwiedii diporus; Kidney; Snake; Envenomation; Venom.

     Los accidentes ofídicos ocasionados por Bothrops neuwiedii (yarará chica), al igual que los producidos por todas las especies de Bothrops, se caracterizan por alteraciones locales como edema, hemorragia, necrosis muscular, y sistémicas como los trastornos de la coagulación1. Estos daños son producidos por la acción de sustancias farmacológicamente activas que interactúan produciendo la sintomatología propia de estos accidentes1, 2. En los casos más graves la insuficiencia renal aguda se presenta como una complicación que puede llevar a la muerte del paciente3, 4. Dentro de las causas relacionadas con la fisiopatología de la falla renal se pueden considerar la presencia de agentes nefrotóxicos directos4, coagulación vascular diseminada5, o enzimas proteolíticas y sustancias vasoactivas que actuarían sobre el riñón6.
     En experiencias previas realizadas en ratones, se  ha demostrado que la intoxicación con veneno de Bothrops neuwiedii  se asocia con cambios en la densidad urinaria y alteraciones en la coloración de la orina a partir de las tres horas7. Estas alteraciones halladas en la orina podrían relacionarse con una nefropatía por pigmentos, término que describe a una insuficiencia renal aguda determinada por mioglobinuria asociada a rabdomiólisis o hemoglobinuria asociada a hemólisis8. Debido al daño muscular local9 se produce elevación marcada de creatinina, creatinfosfoquinasa (CK) y transaminasas8, 9, con un aumento relativo de urea producido por hemorragia y deshidratación8. Si bien las alteraciones en la coagulación constituyen una de las causas que llevan a la muerte del paciente  en los envenenamientos botrópicos,  deberíamos prestar particular atención a la necrosis renal5, 10, 11. Siendo esta una patología reversible siempre que se cumplan ciertas condiciones8, 12, prevenir el daño renal podría ser clave para mejorar el pronóstico10, 11.
      En este trabajo presentamos la evolución del accidente ofídico en ratas a partir de las 3 horas de la inyección de veneno de Bothrops neuwiedii diporus hasta los 30 días de la inoculación. El objetivo es realizar el seguimiento de los parámetros séricos, urinarios y de las lesiones histopatológicas halladas en riñón de los animales envenenados.

Materiales y métodos

Veneno: se trabajó con veneno crudo obtenido por extracción manual a ejemplares adultos de Bothrops neuwiedii diporus provenientes de la provincia de Corrientes. El veneno fue desecado bajo campana de vacío, homogeneizado y conservado a –20°C hasta el momento de su uso.
     Diseño experimental: Para la experiencia se utilizaron 7 grupos. Cada grupo estuvo conformado por 5 ratas machos de la cepa Wistar de 180 ± 20 g de peso, que fueron inyectadas en el músculo gastrocnemio con 700 µg de veneno diluido en 0.1 ml de solución salina amortiguada a pH 7.2. Para obtener las muestras de sangre y tejido renal para el estudio histopatológico, los animales fueron sacrificados mediante dislocación de la articulación atlanto occipital, previa anestesia con hidrato de cloral a la dosis de 0.3 ml/200 g de una dilución de 6 g de hidrato de cloral en 30 ml de agua destilada, aplicados por vía i.p. Los tiempos de exposición al veneno fueron de 3, 6, 12 y 24 horas, 1 y 4 semanas. El grupo control fue inoculado con 0.1 ml de solución salina por la misma vía. Durante toda la experiencia los animales recibieron alimento balanceado rata-ratón, agua ad libitum y fueron mantenidos en ambiente con temperatura controlada (24°C).
     Determinaciones de laboratorio: en los tiempos anteriormente descritos, las extracciones de sangre para la obtención de suero se realizaron de la vena cava posterior. Las determinaciones colorimétricas efectuadas fueron alanin-aminotransferasa (ALT), aspartato-aminotransferasa (AST) (Laboratorio Boehringer Mannheinm, Argentina) y creatin-fosfoquinasa (CK) (Wiener Lab), urea, creatinina, fósforo, calcio, proteínas totales y albúmina (Wiener Lab).
     Análisis de orina: las muestras de orina se recogieron individualmente desde el piso de las jaulas previamente cubierto por una lámina de plástico, en los tiempos descritos (3, 6, 12 , 24 horas, 1 y 4 semanas). Para valorar la densidad se utilizó refractometría. La verificación del pH, presencia o ausencia de glucosa, cuerpos cetónicos, bilirrubina y urobilinógeno se hizo mediante el empleo de tiras reactivas Multistix® de Bayer. Para el estudio del sedimento las muestras fueron centrifugadas a 5000 rpm durante 15 min.
     Histopatología: luego del sacrificio, según lo descrito, los dos riñones fueron fijados en solución de formol bufferado para su posterior procesamiento y coloración con hematoxilina eosina.
     Análisis estadístico: los datos obtenidos a partir de las muestras de suero, fueron tratados como paramétricos y los resultados procesados mediante el análisis de la varianza. Los datos recogidos a partir de las muestras de orina fueron tratados como no paramétricos, aplicándose el test de Kruskall-Wallis.

Resultados

Antes de realizada  la experiencia, todas las ratas eran activas y tenían una producción de orina en cantidad y calidad normal. Luego de la administración del veneno diluido, las ratas dejaron de moverse y se aislaron en un rincón de la jaula, con evidencias clínica de dolor. A las 3, 6, 12 y 24 horas se presentó edema de tren posterior. La recolección de orina de color amarronado-rojizo sólo fue posible en los tres primeros tiempos.
     Los resultados de la bioquímica sérica se presentan en la Tabla 1. La CK presentó su pico máximo a las 3 horas, regresando a valores normales a la semana; en cambio, urea y creatinina fueron más altas a las 6 horas, con valores inferiores a los normales dentro de la primera semana.  En los grupos de 3, 6, 12, 24 horas y 1 semana se observaron diferencias significativas entre los grupos tratados y los controles para CK, urea y creatinina. A las 4 semanas los resultados obtenidos para estos parámetros entre el grupo tratado y el control no mostraron diferencia. En  el caso de calcio y fósforo sus mediciones séricas se mantuvieron sin diferencias significativas entre grupos a lo largo de toda la experiencia (p<0.001). 

TABLA 1.Parámetros clínicos de ratas controles e inoculadas con veneno de Bothrops neuwiedii diporus. En las distintas variables se observaron diferencias significativas (p<0.001) entre los grupos tratados y el control, excepto en los valores de las 4 semanas

*CK: creatinfosfoquinasa

     Las muestras de orina fueron recolectadas y evaluadas en forma individual, las variaciones de volumen se encuentran en la base de la Tabla 1. Las densidades urinarias medidas por refractometría fueron de 1.050 ± 0.030 a las 3 horas, 1.031 ± 0.004 a las 6 horas, 1.005 ± 0.001 a la semana y al mes oscilaron entre 1.005 y 1.060. El test de Kruskall-Wallis descartó la hipótesis nula, ya que al menos uno de los tiempos fue diferente (P<0.001).En todos los casos hubo proteinuria y el pH se mantuvo entre 5.0 y 7.5. En los sedimentos urinarios recogidos a las 3, 6, 12 y 24 horas se observaron cristales de urato amorfo y fosfato triple acompañados de otros cristales de color anaranjado brillante junto con cilindros hialinos, granulosos y celulares.
     El examen histopatológico del tejido renal  reveló, a las 3 y 6 horas luego de la inyección del veneno, la presencia de degeneración hidrópica en las células epiteliales de los túbulos proximales y distales, acompañadas de cilindros hialinos en la luz tubular, dilatación de la luz y congestión renal. A las 24 horas, se observó necrosis difusa del epitelio tubular acompañada por daño glomerular. En este tiempo, la necrosis afectó a una superficie considerable del riñón, principalmente en la unión corticomedular, sin daño de la membrana basal tubular (Fig. 1).  A las 4 semanas había tumefacción de células del epitelio tubular, con dilatación de la luz y cilindros hialinos,  coexistiendo con áreas donde las células epiteliales estaban aplanadas mientras que otros túbulos estaban normales (Fig. 2). No se observó dañó glomerular.


Fig.1.
– Riñón de rata a las 24 horas post inoculación de 700 mg de veneno de B. neuwiedii diporus. En la zona corticomedular se observa necrosis difusa del epitelio tubular con desaparición del detalle celular y membrana basal conservada. (HE, 250X).


Fig. 2.
– Riñón de rata  a las 4 semanas pos inoculación de una dosis de 700 mg de veneno de B. neuwiedii diporus. En la zona cortical se observa infiltrado mononuclear, dilatación tubular (asterisco) y cilindros hialinos (flecha). (HE, 250X).

Discusión

Comparando con las observaciones de De Roodt et al. (1998), quien  informa la recolección por ordeñe manual  de un promedio de 142 ± 31 µg de veneno seco por espécimen de Bothrops neuwiedii de una población de 127 ejemplares de cautiverio13, la dosis elegida de 700 µg por rata de 180 ± 20g podría resultar elevada. No obstante, no se registró mortalidad hasta el momento de finalizada la experiencia. Debemos tener en cuenta que la letalidad de Bothrops neuwiedii difiere según el origen de los ejemplares y del diseño experimental utilizado para su valoración. Así, Oliviera et al. (2002) comunican una DL50 de 128.2 µg/20 g de ratón con valores extremos de 111.0 a 162.8 µg/20 g de ratón para la vía i.p y de 26.6  µg/20 g de ratón y dosis extremas de 22.4 a 33.2 µg/20 g de ratón para la vía e.v del veneno de Bothrops neuwiedii diporus de Argentina. En cambio, el mismo trabajo informa datos de 89.5 µg/20 g, con dosis máxima y mínima de 80.3 a 100.8 µg/20 g,  para la vía i.p y de 49.0  µg/20 g  y datos máximo y mínimo de 40.7 a 56.9 µg/20 g,  para la vía e.v de Bothrops neuwiedii de Bolivia14. Por otra parte, el análisis filogenético utilizado para la clasificación de la actividad de los venenos presentado por Furtado (2002) ha demostrado diferencias en el grupo correspondiente a  B. neuwiedii15, por lo que se requerirían nuevos estudios para poder explicar las diferencias halladas respecto a la letalidad de los diferentes ejemplares de esta especie de Bothrops.
     El presente trabajo  muestra el desarrollo de insuficiencia renal aguda producida por la inyección de veneno de Bothrops neuwiedii diporus en ratas de la cepa Wistar, como resultado de necrosis en las células epiteliales tubulares renales. La necrosis franca del tejido renal no es una patología de hallazgo frecuente, cuando se presenta lo puede hacer en forma focal o comprometiendo a las células epiteliales tubulares12. En nuestro ensayo, se observaron cilindros hialinos en la luz tubular tres horas después de la inoculación, junto a otros cilindros de color anaranjado brillante que podrían tener su origen en la mioglobina liberada a la circulación desde el área de inoculación donde se produce mionecrosis8, 9.
     Sin dejar de lado los fenómenos hipotensivos que los venenos botrópicos ejercen sobre la circulación16, 17 con disminución de la perfusión renal y daños isquémicos renales18, debemos considerar que el veneno de B. neuwiedii diporus, al igual que otros venenos ofídicos como el  de Pseudechis australis19, posee nefrotoxicidad asociada a pigmentos16 . A las 3 horas se pudo observar células tubulares con degeneración hialina y hacia las 6 horas necrosis tubular acompañada por cilindros hialinos y dilatación tubular5, 10. En este tiempo se registraron los valores más altos de CK (1.246 ± 152 UI/l), de creatinina (19.60 ± 1.51 mg/dl) y urea (1.10 ± 0.22 g/dl). La orina en cambio se mantuvo concentrada con una densidad de 1.031± 0.004 y una producción promedio de 0.83 ml/3 horas por rata. En este caso, la elevación rápida de la creatinina asociada a un menor volumen urinario durante las primeras tres horas sugiere la posibilidad de una insuficiencia renal aguda (IRA)20 y si se considera los cambios de coloración se podría asumir una nefropatía por pigmentos8. En este tiempo, la densidad se mantuvo dentro de parámetros normales, pero deberíamos considerar que el peso específico depende del número y del peso de los solutos21, siendo modificado por la presencia de glucosa y proteínas21 que estuvieron presentes en las orinas estudiadas en este tiempo.
     Los fenómenos histopatológicos de necrosis tubular alcanzaron su máxima expresión hacia las 24 horas coincidiendo con el momento de máximas alteraciones en los análisis físico-químicos de orina con una densidad promedio de 1.014 ± 0.119, y una diuresis de 0.3 a 5 ml por rata cada 3 horas. En cambio, los parámetros séricos comenzaron a descender con un valor de CK de 963.40 ± 71.13 UI/l, creatinina de 11.40 ± 3.50 mg/dl y urea de 0.47 ± 0.09 g/dl. Considerando que la densidad se utiliza para valorar la capacidad de concentrar que tienen los riñones en un esfuerzo para mantener la homeostasis21, hacia las 24 horas el aumento del volumen urinario con una densidad baja permitiría inferir por medio de un técnica sencilla y económica el daño renal observado en la histopatología20, 21. Al mes, el tejido renal presentaba degeneración hidrópica de las células epiteliales tubulares con congestión e infiltrado mono-morfo nuclear en el intersticio y cilindros hialinos en la luz tubular. Las muestras de orina presentaron  un comportamiento variable, algunas con una densidad muy baja (1.005) y otras normales (1.060), observándose cilindros hialinos que se relacionaron con los observados en la histopatología. Los parámetros de laboratorio estudiados se encontraron dentro de límites normales con CK de 364.80 ± 148 UI/l, creatinina de 12 ± 2.44 mg/dl y urea de 0.29 ± 0.05 g/dl. Relacionando los resultados de los análisis clónicos, urianálisis y la histopatología resulta que la densidad urinaria fue más eficiente para valorar la evolución del daño renal en el accidente botrópico7, 20,  21,  22.
     Podemos concluir que la inyección i.m. de veneno de Bothrops neuwiedii diporus  en ratas indujo cambios en la función renal compatibles con  falla renal aguda, acompañada por lesiones degenerativas del epitelio tubular renal, y que tales lesiones se evidenciaron mejor con  técnicas histopatológicas que con las convencionales de laboratorio.

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Recibido: 13-05-2003
Aceptado: 14-04-2004