CARACTERIZAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA EM COUVE-MANTEIGA UTILIZANDO ISOENZIMAS E RAPD(¹)

 

HAIKO ENOK SAWAZAKI(²), HIROSHI NAGAI(³) e LADASLAV SODEK(⁴)

 

 

RESUMO

Estudou-se a variabilidade genética em couve (Brassica oleracea L. var. acephala D.C.) tipo manteiga por intermédio do polimorfismo enzimático em gel de poliacrilamida e do polimorfismo de DNA, denominado RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), com base na amplificação de segmentos de DNA ao acaso. Avaliaram-se quinze clones de couve-manteiga do Banco Ativo de Germoplasma do Instituto Agronômico (IAC), utilizando-se extratos de folhas para análise de isoenzimas e marcador RAPD com os "primers" dos kits A e B da Operon Technologies. Entre as isoenzimas estudadas, as mais polimórficas foram as fosfoglucomutase (PGM), peroxidase (PRX) e esterase (EST), tendo o sistema PGM realizado a melhor caracterização. Verificou-se a ocorrência de variabilidade genética por meio de isoenzimas e RAPD, porém não foi observada a similaridade entre os dendrogramas obtidos por ambos os tipos de marcadores, sugerindo que as isoenzimas forneceram menos informação sobre o genoma. A maior eficácia do RAPD foi devida à possibilidade de processar maior número de análises, evidenciando mais detalhes sobre o genoma.

Termos de indexação: couve, marcadores genéticos, isoenzimas, RAPD.

 

ABSTRACT

CHARACTERIZATION OF GENETIC VARIABILITY OF KALE PLANTS BY ENZYMATIC POLYMORPHISM AND RAPD

Genetic variability of kale plants (Brassica oleracea L. var. acephala D.C.) was studied by means of enzymatic polymorphism using polyacrilamide gel electrophoresis and a DNA polymorphism assay based on RAPD. Fifteen clones of kale var. acephala from IAC germplasm collection were studied. Leaf extracts were analysed for isozymes and RAPD markers using A and B kits of primers. Isozyme polymorphism was observed for phosphoglucose mutase (PGM), peroxidase (PRX) and esterase (EST) and was higher for PGM. Differences among clones were observed by isozymes and RAPD, however, the dendrograms obtained from both kinds of markers were dissimilar, suggesting that the isozymes provided less information than RAPD about the genome. The superior efficiency of the RAPD was due to its ability to process a larger number of samples, making details about genome more evident.

Index terms: kale, genetic markers, isozymes, RAPD.

 

 

1. INTRODUÇÃO

O Instituto Agronômico (IAC), desde sua criação, em 27 de junho de 1887, vem trabalhando com recursos genéticos vegetais, sendo cada melhorista responsável pela coleção ou banco de germoplasma disponível em sua área (Veiga & Nucci, 1995). O conhecimento e a ampliação do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) são, portanto, imprescindíveis para a utilização de recursos genéticos.

A couve (Brassica oleracea L. var. acephala D.C.) é uma planta que apresenta grande diversidade, tendo Corrêa (1931) descrito a manteiga como um dos 22 tipos encontrados no Brasil; no IAC, seu germoplasma é identificado apenas pela procedência, sendo necessário o conhecimento da diversidade genética para auxílio dos programas de melhoramento.

Nijenhuis (1971) iniciou os trabalhos de análise de variação intra-específica em B. oleracea, estudando o polimorfismo isoenzimático do sistema da fosfatase ácida (ACP). Arús & Shields (1983) estudaram, além desse sistema em brássicas, o polimorfismo de fosfoglucose isomerase (PGI), fosfoglucomutase (PGM), leucina aminopeptidase (LAP), álcool desidrogenase (ADH) e glutamato-oxalo-acetato-transaminase (GOT), observando dois genes codificando os sistemas monoméricos PGM e LAP, dois lócus e pelo menos um sistema dimérico em PGI e ADH, e três genes em GOT.

Amaral Junior et al. (1994), comparando a variabilidade genética entre clones de sete tipos de couve-comum por meio de sete caracteres isoenzimáticos (esterase - EST; fosfatase ácida - ACP; glutamato desidrogenase - GDH; aminopeptidase - LAP; glutamato-oxalo-acetato-transaminase - GOT; malato desidrogenase - MDH e peroxidase - PRX), com base no índice de Jaccard, e de seis descritores botânico-agronômicos, fundamentada na distância euclidiana média, encontraram a dissimilaridade genética entre os tipos de marcadores pesquisados.

Com relação à utilização de marcadores moleculares, Hu & Quiros (1991) identificaram catorze cultivares de brócolis (B. oleracea L. var. italica P.) e doze cultivares de couve-flor (B. oleracea L. var. botrytis L.) através do perfil de bandas geradas pelo marcador RAPD, usando apenas quatro "primers" de 10 bases. Segundo os autores, os marcadores gerados por apenas dois ou três "primers" foram suficientes para distinguir cada um dos cultivares pesquisados.

Horn & Rafalski (1992) descreveram um ensaio RAPD em embriões de Brassica napus derivados de cultura de microsporos, relatando a possibilidade de centenas de ensaios serem realizados com o DNA obtido de um fragmento de cotilédone, permitindo a regeneração do embrião restante, além de originar plantas com o genoma discriminado. Kresovich et al. (1992) também utilizaram marcador RAPD para caracterizar a identidade genética e a diversidade em Brassica oleracea.

Este trabalho teve como objetivo, caracterizar geneticamente, por meio de isoenzimas e RAPD, germoplasma representativo dos BAGs de couve do Instituto Agronômico.

 

2. MATERIAL E MÉTODOS

Realizou-se caracterização por polimorfismo enzimático e pela técnica RAPD em couve (Brassica oleracea L. var. acephala), utilizando-se as primeiras folhas de plantas desenvolvidas e mantidas em condições de campo pela Seção de Hortaliças Diversas e de Frutos do IAC. Quinze clones de couve-manteiga foram investigados: Ribeirão Pires 2620 (procedência Ribeirão Pires); 1811 (procedência Monte Alegre do Sul); Roxa (procedência desconhecida); São Roque (procedência desconhecida); Gigante 915 (procedência Jardim Guanabara, Campinas); 916 (procedência Santa Elisa, Campinas); Crespa (procedência Piracicaba); Ribeirão Pires 2446 (procedência Ribeirão Pires); Crespa (procedência Capão Bonito); Tupi (procedência desconhecida); Jundiaí (procedência desconhecida); Mococa (procedência desconhecida); São José (procedência Nelson Mendonça); Roxa Monte Alegre (procedência Monte Alegre do Sul) e Verde-Escura (procedência desconhecida).

Para os estudos dos sistemas PGM, EST, PRX, IDH (isocitrato desidrogenase), GOT e MDH, as folhas foram coletadas e manuseadas em condições de temperatura ao redor de 4^oC. Foram utilizados extratos frescos, eletroforese em gel de poliacrilamida e sistemas de reação enzimática de acordo com Sawazaki (1995).

Efetuou-se a extração do DNA genômico, mediante ajuste do método de Shillito & Saul (1988). As concentrações de DNA foram determinadas no minifluorímetro TKO 100 da Hoefer.

Utilizaram-se para as reações com RAPD os kits de "primers" A e B de 10 bases da Operon Technologies e o termociclador Gene Ataq da Pharmacia. As reações foram realizadas em volume de 25 mL contendo 10 mM tris-HCl pH 8,3; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl₂; 0,1 mM de cada dATP, dTTP, dGTP e dCTP; cinco picomoles de um dos "primers" de 10 mers, 20-25 ng de DNA genômico e 2,0 unidades de Taq DNA polimerase (GIBCO). A amplificação foi feita com aquecimento inicial de três minutos a 94^oC para denaturação inicial de DNA e, a seguir, 35 ciclos de 45 segundos a 94^oC, trinta segundos a 34^oC e um minuto e trinta segundos a 72^oC, seguida de sete minutos a 72^oC para a completa extensão de todas as cadeias complementares. O DNA amplificado foi analisado em gel de agarose 1,2% com tampão TAE (40 mM tris-acetato; 1 mM EDTA) e fotografado com câmara polaróide.

Realizou-se o estudo da diversidade genética por meio da análise multivariada do programa NTSYS, utilizando-se a matriz de distância produzida pelo coeficente de similaridade denominado "simple matching" cujo algoritmo é Sm = a + d / a + b + c + d. Quando a característica está simultaneamente presente nas populações de dois clones, o número de casos é a; em uma das populações, é b; na outra população, é c; ausente em ambas as populações, é d. Os dendrogramas foram construídos com base no método de agrupamento UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic mean) à medida que os dados de cada "primer" foram obtidos. Utilizou-se o consenso de Stinebrickner para a comparação entre dendrogramas. Para a formação de grupos pelo método de otimização de Tocher, adotou-se o critério segundo o qual a distância média intragrupo é inferior a toda distância intergrupo (Amaral Junior et al., 1994). Foram consideradas apenas as bandas com grande intensidade, sendo as análises repetidas pelo menos duas vezes.

 

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.l Polimorfismo enzimático

PGM - A figura 1 mostra um gel e um diagrama representativo dos fenótipos correspondentes às isoenzimas do sistema PGM. As isoenzimas de PGM apresentaram o maior polimorfismo, sendo encontradas de duas a cinco bandas em uma mesma região. Arús & Shields (1983), trabalhando com brássicas, observaram dois genes codificando para o PGM, denominados Pgm-1 e Pgm-2, sendo as aloenzimas de Pgm-1 de migração mais rápida. Segundo esses autores, cada alelo do Pgm-1 codificou o fenótipo de um par de bandas, sendo a mais rápida, de cada par, menos ativa que a de migração mais lenta. Ainda de acordo com esses autores, o sistema protéico foi monomérico, proveniente de quatro aloenzimas. Por outro lado, como foi verificada ocasionalmente a formação de três bandas, em vez de duas, nos clones Roxa (3) e Tupi (10), pode também ser formulada a hipótese de ocorrerem dois lócus codificando o sistema dimérico com a formação eventual da banda do heterodímero interlócus em adicão às três codificadas pelo lócus heterozigoto, e à banda do lócus homozigoto. A presença de duas bandas, porém, na região codificada pelo lócus Pgm-2, indica a presença de proteínas monoméricas. É, portanto, mais provável a ocorrência de dois lócus codificando sistemas monoméricos, denominados Pgm-1, mais próximo ao ânodo e Pgm-2, mais distante, de acordo com Arús & Shields (1983). Como, porém, não foi observado o fenótipo de um par de bandas correspondente a cada alelo do gene Pgm-1, denominaram-se as bandas de acordo com a velocidade de migração nas duas regiões observadas. A presença de uma banda forte com subdivisão pôde ser observada na mais rápida de vários clones como Crespa Piracicaba (7), Tupi (10) e São José (13), sugerindo a presença de duas bandas muito próximas. No clone Gigante 915 (5) foram observadas, algumas vezes, cinco bandas distintas, reforçando a existência dessa banda mais rápida. Os clones apresentaram, portanto, duas ou três, três ou quatro e quatro ou cinco bandas. Tal sistema não diferenciou apenas os clones 916, Ribeirão Pires 2446 e São José.

 

Figura 1. Zimograma de PGM de couve. Início na parte inferior, ânodo no topo.1 = Ribeirão Pires 2620 com bandas na região A e B: B, E, G, H; 2 = 1811 C, G; 3 = Roxa B, C, G, H; 4 = São Roque A, C, E, G, H; 5 = Gigante 915 C, D, F, G, H; 6 = 916 C, G, H; 7 = Crespa Piracicaba A, E, G, H; 8 = Ribeirão Pires 2446 C, G, H; 9 = Crespa Capão Bonito C, E, G; 10 = Tupi B, G, H; 11 = Jundiaí C, F, I; 12 = Mococa C, E, I; 13 = São José C, G, H; 14 = Roxa Monte Alegre A, C, F, I; 15 = Verde-Escura A, C, E, F, I.

 

PRX - A figura 2 mostra um gel e um diagrama representativo dos fenótipos correspondentes às isoenzimas do sistema PRX. O sistema PRX apresentou bandas em duas regiões, a saber: a região mais distante da origem (Figura 2B), com uma banda monomórfica, forte e similar para todos os clones e a região mais próxima à origem (Figura 2A), com polimorfismo de uma ou duas bandas, antecedida por uma banda que, por não ser sempre constante, não foi considerada. Nessa região mais próxima à origem, foi observado o fenótipo de uma ou duas bandas denominadas A1 e B1. Tal sistema diferenciou os clones Gigante 915 (5) e Verde-Escura (15) e os clones São Roque (4) e Crespa Capão Bonito (9) dos demais.

 

Figura 2. Zimograma de PRX de couve. Início na parte inferior, ânodo no topo. 1 = Ribeirão Pires 2620 com bandas na região A: B1 Região B com banda monomórfica; 2 = 1811 B1; 3 = Roxa B1; 4 = São Roque A1 e B1; 5 = Gigante 915 A1; 6 = 916 B1; 7 = Crespa Piracicaba B1; 8 = Ribeirão Pires 2446 B1; 9 = Crespa Capão Bonito A1 e B1; 10 = Tupi B1; 11 = Jundiaí B1; 12 = Mococa B1; 13 = São José B1; 14 = Roxa Monte Alegre B1; 15 = Verde-Escura A1.

 

EST - A figura 3 mostra um diagrama representativo dos fenótipos correspondentes às isoenzimas do sistema EST. O zimograma de EST apresentou bandas em duas regiões denominadas A e B. Na região mais próxima à origem (Figura 3A) os clones apresentaram um padrão similar de uma ou duas bandas, mais avançadas, seguidas por uma difusa e novamente uma banda distinta. Essa região polimórfica mais avançada, constituída por uma ou duas bandas, pode ser definida por um lócus codificando proteínas monoméricas. As outras bandas que podem ser codificadas por outros lócus não foram consideradas. Os clones Jundiaí (11) e Mococa (12) apresentaram, portanto, o fenótipo de duas bandas denominadas A1 e B1, e os restantes, apenas a banda A1.

Na região mais rápida (Figura 3B), os clones apresentaram polimorfismo apenas nas bandas mais avançadas, às quais se seguiu uma banda mais atrasada e difusa, semelhante para todos. Essa região mais próxima ao ânodo apresentou o fenótipo de uma ou duas bandas, com as quatro migrações (A, B, C e D), podendo ser caracterizada por proteínas monoméricas. Os clones São Roque (4), Gigante 915 (5) e Mococa (12) apresentaram uma banda, enquanto os outros clones demonstraram duas; Ribeirão Pires 2446 (8) e Jundiaí (11) apresentaram uma das bandas diferente em relação às demais.

Figura 3. Zimograma de EST de couve. Início na parte inferior, ânodo no topo. 1 = Ribeirão Pires 2620 com bandas na região A: A1 e região B: B2; 2 = 1811 A1 e B2; 3 = Roxa A1 e B2; 4 = São Roque A1 e C2; 5 = Gigante 915 A1 e C2; 6 = 916 A1 e B2; 7 = Crespa Piracicaba A1 e B2; 8 = Ribeirão Pires 2446 A1 e A2, C2; 9 = Crespa Capão Bonito A1 e B2; 10 = Tupi A1 e B2; 11 = Jundiaí A1, B1 e B2, D2; 12 = Mococa A1, B1 e C2; 13 = São José A1 e B2; 14 = Roxa Monte Alegre A1 e B2; 15 = Verde-Escura A1 e B2.

 

IDH - O sistema IDH apresentou bandas em duas regiões, tendo, na mais avançada, uma banda similar para todos os clones, caracterizando ser codificada por um provável lócus. A região mais próxima à origem apresentou um padrão mais polimórfico, porém com bandas que não foram repetitivas e não foram consideradas.

GOT - O sistema GOT também não apresentou muito polimorfismo, sendo verificado um padrão de, pelo menos, três bandas em uma região, similar em todos os clones, com exceção de Roxa Monte Alegre (14) e Verde-Escura (15) que apresentaram quatro a cinco bandas. Como segundo Arús & Shields (1983), o sistema GOT é codificado por três lócus, sendo o mais próximo à origem dimérico, o fenótipo de cinco bandas pode provavelmente estar indicando o genótipo heterozigoto em Roxa Monte Alegre e Verde-Escura.

MDH - O sistema MDH não se apresentou bem definido, sendo, porém, verificada a existência de bandas em uma região mais avançada antecedida por um padrão de rastro variável. Essa região apresentou de uma a três bandas de um sistema formado provavelmente por proteínas diméricas. Se essa região fosse codificada por um lócus, os clones Roxa Monte Alegre (14) e Verde-Escura (15) apresentariam o padrão de três bandas correspondentes ao genótipo heterozigoto, enquanto as demais, o genótipo homozigoto.

 

3.2 Polimorfismo de marcador RAPD e dendrograma UPGMA

A figura 4 mostra a fotografia do gel e o diagrama representativo dos fenótipos correspondentes às amplificações polimórficas do DNA genômico através das extensões iniciadas pelos "primers" A9 e B4 produzindo sete bandas entre os clones de couve. O exemplo ilustra a ocorrência de polimorfismo pelo "primer" A9 nas bandas B, D e F e pelo "primer" B4 nas bandas A e D. O número de fragmentos polimórficos amplificados pelos "primers" estudados variaram de 8 a 0. Os "primers" utilizados e a quantidade dos fragmentos polimórficos obtidos estão relacionados no quadro 1.

 

Figura 4. Perfil tipo RAPD para os "primers" A9 e B4 em couve: 1 = Ribeirão Pires 2620; 2 = 1811; 3 = Roxa; 4 = São Roque; 5 = Gigante 915; 6 = 916; 7 = Crespa Piracicaba; 8 = Ribeirão Pires 2446; 9 = Crespa Capão Bonito; 10 = Tupi; 11 = Jundiaí; 12 = Mococa; 13 = São José; 14 = Roxa Monte Alegre; 15 = Verde-Escura.

 

 

Os dados de polimorfismo, obtidos através dos "primers", foram analisados pelo programa NTSYS, adicionando-se os resultados à medida que foram sendo observados.

Os coeficientes co-fonéticos dos dendrogramas construídos pelas dezoito bandas polimórficas correspondentes às isoenzimas (Figura 5), e pelas 127 bandas polimórficas do marcador RAPD (Figura 6) foram, respectivamente, 0,90866 e 0,89127. Dendrogramas obtidos pelo marcador RAPD a partir de 113 bandas não foram diferentes dos obtidos com 127 bandas, confirmando que o número de dados foi suficiente. Da correlação entre os dendrogramas de isoenzimas e RAPD pelo método de Stinebrickner (Figura 7), obtiveram-se grupos de ligações diferentes dos originais, indicando a baixa similaridade entre ambos os dendrogramas. Mediante a formação de grupos pelo método de Tocher, verificou-se que o marcador RAPD foi mais eficiente na discriminação genotípica, pois possibilitou a formação de nove grupos, enquanto as isoenzimas formaram apenas um grande grupo dividido em seis subgrupos (Quadro 2). Observa-se que apenas os clones 3 e 6, 11 e 12 e 14 e 15 foram concordantes em ambos os marcadores, evidenciando diferenças acima de 50% entre os grupos de ligação obtidos pelas isoenzimas e marcador RAPD.

 

 

 

Figura 5. Dendrograma das dezoito bandas polimórficas das isoenzimas de couve. 1 = Ribeirão Pires 2620; 2 = 1811; 3 = Roxa; 4 = São Roque; 5 = Gigante 915; 6 = 916; 7 = Crespa Piracicaba; 8 = Ribeirão Pires 2446; 9 = Crespa Capão Bonito; 10 = Tupi; 11 = Jundiaí; 12 = Mococa; 13 = São José; 14 = Roxa Monte Alegre; 15 = Verde-Escura.

 

 

Figura 6. Dendrograma das 127 bandas polimórficas do marcador RAPD em couve. 1 = Ribeirão Pires 2620; 2 = 1811; 3 = Roxa; 4 = São Roque; 5 = Gigante 915; 6 = 916; 7 = Crespa Piracicaba; 8 = Ribeirão Pires 2446; 9 = Crespa Capão Bonito; 10 = Tupi; 11 = Jundiaí; 12 = Mococa; 13 = São José; 14 = Roxa Monte Alegre; 15 = Verde-Escura.

 

 

Figura 7. Correlação entre os dendrogramas de isoenzimas e de RAPD em couve. 1 = Ribeirão Pires 2620; 2 = 1811; 3 = Roxa; 4 = São Roque; 5 = Gigante 915; 6 = 916; 7 = Crespa Piracicaba; 8 = Ribeirão Pires 2446; 9 = Crespa Capão Bonito; 10 = Tupi; 11 = Jundiaí; 12 = Mococa; 13 = São José; 14 = Roxa Monte Alegre; 15 = Verde-Escura.

 

Quanto à dissimilaridade entre os dendrogra mas obtidos pelas isoenzimas e marcador RAPD, poder-se-ia supor que fosse decorrente dos poucos dados de isoenzimas, pois não foi observada muita variabilidade genética em vários sistemas enzimáticos, o que confirma os resultados de Amaral Junior et al. (1994). De acordo com esses autores, o fato de a principal forma de reprodução ser por via assexuada pode resultar no estreitamento genético e na reduzida variabilidade isoenzimática entre os clones estudados. Por outro lado, como a diversidade genética em couve é alta (Corrêa, 1931), tal explanação não é convincente.

Em relação à discordância entre caracteres morfométricos e isoenzimáticos, Price et al. (1984) compararam estimativas de diferenciação interpopulacional, com base no polimorfismo de aloen- zimas e medidas de caracteres morfológicos, em três espécies predominantemente autógamas, e em uma espécie alógama. Segundos esses autores, o grau de correlação entre distância da diversidade morfológica e distância genotípica, medida pelas isoenzimas, foi positiva e significante, ou medianamente significante, para as espécies autógamas e não significante, para a espécie alógama, sugerindo que os lócus isoenzimáticos das plantas autógamas forneceram mais informação sobre o genoma. Considerando a grande diversidade encontrada em couve, pode-se supor a ocorrência de cruzamentos direcionados pelo homem, mediante seleção ao longo dos anos de domesticação, ocasionando uma variabilidade genética e, além disso, o fato de as isoenzimas estudadas fornecerem menos informação sobre o genoma. Deve-se ressaltar, no entanto, que segundo Hamrick (1989), o relacionamento entre padrões de variação aloenzimática e padrões de variação genética não é ainda claro, sendo os resultados disponíveis até agora não elucidativos, uma vez que indicam associação positiva em alguns casos, enquanto noutros inexiste associação.

Pela junção das dezoito bandas de isoenzimas e das 127 bandas polimórficas do marcador RAPD, obteve-se um dendrograma com ligações entre os clones semelhantes às originadas pelo RAPD, apesar do menor coeficiente co-fonético, 0,86641, confirmando, pois, a variabilidade genética obtida por esse tipo de marcador. Foi comprovada, portanto, a maior eficácia do marcador RAPD em relação às isoenzimas em couve, pois sua habilidade na execução de grande número de análises facilita o estudo de muitos genes, permitindo maior conhecimento do genoma.

As ligações mais próximas ocorreram entre os clones Roxa Monte Alegre e Verde-Escura e os clones Roxa e 916. Estes últimos clones foram conectados ao Crespa Piracicaba e, a seguir, à ligação entre os clones 1811 e Gigante 915. O grupo resultante conectou-se à ligação entre os clones Ribeirão Pires 2620 e São Roque, formando um agrupamento que, em seguida, uniu-se ao dos clones Ribeirão Pires 2446 com Crespa Capão Bonito mais Tupi. Esse agrupamento final ficou conectado ao formado pelas ligações entre os clones Jundiaí e Mococa com São José mais Roxa Monte Alegre e Verde-Escura.

 

4. CONCLUSÕES

1. O polimorfismo enzimático e de RAPDs observado em couve possibilitou a diferenciação entre os clones estudados.

2. Os dendrogramas produzidos pelas bandas das isoenzimas e pelo marcador RAPD não foram similares, sugerindo que os lócus isoenzimáticos de couve forneceram menos informação sobre o genoma.

3. A junção das bandas das isoenzimas e do RAPD originou um dendrograma similar ao deste último marcador. Comprovou-se, pois, a maior eficácia da técnica RAPD para a caracterizaçãodos clones estudados, uma vez que possibilita facilmente grande número de análises, fornecendo maior informação sobre o genoma.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à International Foundation For Science o auxílio financeiro.

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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(¹) Trabalho realizado com o apoio financeiro da International Foundation For Science (IFS). Recebido para publicação em 3 de setembro e aceito em 28 de fevereiro de 1997.

(²) Seção de Fitoquímica, Instituto Agronômico (IAC), Caixa Postal 28, 13001-970 Campinas (SP).

(³) Seção de Hortaliças Diversas e de Frutos, IAC.

(⁴) Departamento de Fisiologia Vegetal, UNICAMP, Caixa Postal 6109, 13083-970 Campinas (SP).