Original Experimental Research Journal of Chinese Integrative Medicine: Volume 6 April, 2008 Number 4DOI: 10.3736/jcim20080412 Effects of Huoxue Qianyang Formula on expressions of proto-oncogenes c-fos and c-myc in spontaneous hypertensive rats with ventricular hypertrophy 1. De-yu FU (Department of Cardiology, Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200437, China E-mail: E-mail: fdy65@163.com ) 2. Shi-hong WANG (Department of Cardiology, Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200437, China ) 3. Duan ZHOU2 (Department of Cardiology, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China ) 4. Yu-ying MA (Department of Cardiology, Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200437, China ) 5. Lu JIN (Department of Cardiology, Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200437, China ) 6. Liang-hua ZU (Department of Cardiology, Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200437, China )
Objective: To explore the possible mechanism of Huoxue Qianyang Formula (HXQYF), a compound traditional Chinese herbal medicine, in reversing the left ventricular hypertrophy (LVH) of spontaneous hypertensive rats (SHRs) by analyzing the expressions of mRNAs and proteins of proto-oncogenes c-fos and c-myc in left ventricular muscle.
Methods: The experimental study was carried out in SHRs, the sex- and age-matched Wistar-Kyoto (WKY) rats were served as normal control (n =5, normal saline 10 ml/kg daily). Twenty-five SHRs were randomly divided into five groups: untreated group (n =5, normal saline 10 ml/kg daily), high-dose HXQYF-treated group (n =5, 0.84 g/ml HXQYF, 10 ml/kg daily), medium-dose HXQYF-treated group (n =5, 0.42 g/ml HXQYF, 10 ml/kg daily), low-dose HXQYF-treated group (n =5, 0.21 g/ml HXQYF, 10 ml/kg daily) and cilazapril-treated group (n =5, 1 mg/ml cilazapril, 10 ml/kg daily). The drugs were intragastrically administered once daily for 14 weeks. The expressions of mRNAs and proteins of proto-oncogenes c-fos and c-myc in left ventricular muscle were detected separately by in situ hybridization histochemical method and immunohistochemical method.
Results: Compared with the normal control group, the expressions of mRNAs and proteins of proto-oncogenes c-fos and c-myc in left ventricular muscle were significantly increased in untreated group (P <0.01). After treatment, the expressions of c-fos and c-myc mRNAs in left ventricular muscle in HXQYF-treated groups were significantly down-regulated as compared with those of the untreated group (P <0.05). The expressions of c-myc protein were also significantly decreased in high- and medium-dose HXQYF-treated groups as compared with the untreated group (P <0.05), but it had no significant effects in protein expression of c-fos in the three HXQYF-treated groups.
Conclusion: HXQYF can inhibit the expression of c-myc in ventricular hypertrophy tissue, which may be the mechanism in treating LVH of hypertention.
Fu DY, Wang SH, Zhou D, Ma YY, Jin L, Zu LH. J Chin Integr Med/Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2008; 6(4): 387-391. Received January 7, 2008; published online April 15, 2008. Free full text (PDF) is available at www.jcimjournal.com . Indexed/abstracted in and full text link-out at PubMed. Forward linking and reference linking via CrossRef. DOI: 10.3736/jcim20080412
Correspondence: De-yu FU, MD, Associate Professor; Tel: 021-65161782-3227; E-mail: fdy65@163.com
基金项目 : 上海市卫生局资助项目 (No. 99406,); 国家自然科学基金资助项目 (No. 30572381)
高血压左心室肥厚（ left ventricular hypertrophy, LVH ）是高血压病治疗中亟待解决的重要环节［ 1 ］ 。c-fos 和 c-myc 为即刻早期癌基因，是诱发心肌肥厚的始动因子［ 2 ］ 。现代医学研究表明，c-fos 和 c-myc 表达的变化，可能是心肌肥厚信号介导过程的一部分［ 3 , 4 ］ 。有人推荐c-fos 和 c-myc 在临床基础研究中，可作为心肌肥厚存在的分子生物学标记。既往研究显示，具有活血化瘀、平肝潜阳和祛痰功效的活血潜阳方可降低高血压患者的左心室肥厚程度［ 5 ］ 。本研究进一步观察活血潜阳方对自发性高血压大鼠（spontaneous hypertensive rat, SHR ）左心室心肌原癌基因 c-fos 、 c-myc 基因和蛋白表达的影响，以期为中药治疗高血压 LVH 的临床应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物 SHR 10周龄， 25 只，体质量（ 194±49 ） g ，正常京都（ Wistar-Kyoto, WKY ）大鼠， 10 周龄， 5 只，体质量（ 250±78 ） g ，均由上海市高血压研究所提供（许可证号： SHR 0237-1 ， WKY 0237-2 ）。 1.1.2 药物与主要试剂 活血潜阳方（ Huoxue Qianyang Formula, HXQYF ），由丹参、水蛭、钩藤和石决明等组成，由岳阳医院制剂室制成浸膏，每克含生药 8 g 。用蒸馏水制成大、中、小浓度溶液。西拉普利片（ 2.5 mg/ 片）由上海罗氏制药有限公司生产，批号为国药准字 X19990244 ，用蒸馏水配制成 1 mg/ml 浓度溶液。 c-fos 和 c-myc 多克隆抗体， Santa Cruz 公司生产，工作浓度为 1 ︰ 100 ；生物素化抗地高辛抗体 1 ︰ 500 稀释，购自罗氏公司； EnVision 试剂， Dako 公司生产。 c-fos 和 c-myc 多相寡核苷酸探针，博士德公司生产，均为地高辛标记；聚乙二醇辛基苯基醚（ Triton X-100 ），国药集团。无酶水和 0.1% 焦碳酸二乙脂（ diethyl pyrocarbonate, DEPC ）水放置 12 h 后，高压灭菌 30 min 备用。 1.1.3 实验仪器 自动切片机，日本 AIWA 公司生产； OLYMPUS BH2 型显微镜，日本奥林巴斯公司生产，稳定电压为 4.03 V ；透射电镜，日立 H-600 型； Panasonic 摄像机，分辨率 480 线，日本松下公司生产； IMS 细胞图像分析系统，免疫组化定量分析软件，上海申腾信息技术有限公司生产。 1.2 实验方法 1.2.1 分组及用药 SHR 随机各分为 5 组，每组 5 只（ 4 雄、 1 雌）。具体分为 SHR 模型组，中药大（生药浓度 0.84 g/ml ，相当于成人剂量的 24 倍）、中（生药浓度 0.42 g/ml ，相当于成人剂量的 12 倍）和小（生药浓度 0.21 g/ml ，相当于成人剂量的 6 倍）剂量治疗组，西拉普利组。 WKY 大鼠 5 只（ 4 雄、 1 雌）作为正常对照组。按 10 ml/(kg·d) 不同药液灌胃，模型组和 WKY 组予等量蒸馏水灌胃。其中活血潜阳方低剂量组死亡 1 只（雌）。 1.2.2 标本采集 各组喂养 14 周后，称取体质量，给予 3 ％戊巴比妥钠（ 40 mg/kg ）腹腔注射麻醉动物，即刻取出心脏，进行主动脉逆行灌洗（ 4 ℃ 生理盐水），即刻（ 5 min 内）以无酶水配制的 4% 多聚甲醛固定液固定，固定液容量为组织块体积的 10 倍。每组有 3 只（ 2 雄、 1 雌）大鼠的心脏进行 c-fos 、 c-myc 免疫组化及原位杂交实验（余进行胶原 Ⅰ 、 Ⅲ 的基因和蛋白表达实验，文章待发表）；每只大鼠每个指标取 3 张切片（共得 9 个数据）。操作时需无菌，取材器械事先进行高压灭菌，尽量做到无 RNA 酶，固定标本后尽早进行石蜡包埋。 1.2.3 免疫组化法检测心肌组织 c-fos 和 c-myc 蛋白表达 左室游离壁，常规固定，石蜡包埋，切片，石蜡切片以二甲苯脱蜡及梯度酒精（无水酒精至 50% ）脱水。 pH 6.0 柠檬酸缓冲液入微波炉煮沸 8 min ， PBS 缓冲液冲洗 3 次 ×3 min ， 0.3% 过氧化氢甲醇液阻断内源性过氧化物酶，室温下 20 min ， PBS 冲洗 3 次 ×3 min ，正常动物血清保护，室温下 20 min ，滴加 c-fos 和 c-myc 抗体，平放于湿盒内， 37 ℃ 孵育 1.5 h ， PBS 冲洗 3 次 ×3 min ，滴加 EnVision ，放入湿盒内，室温下 30 min ， PBS 冲洗 3 次 ×3 min ，二氨基联苯胺（ diaminobenzidine, DAB ）显迹，苏木素染核 1 min ， 1% 盐酸酒精分化，流水冲洗蓝化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察心肌细胞，核棕黄色者为阳性细胞。 1.2.4 原位杂交法检测心肌组织 c-fos 和 c-myc mRNA 表达 左心室游离壁，无 RNA 酶的条件下固定、浸蜡包埋。石蜡切片二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水， PBS 洗 2 次 ×3 min ；切片入 0.01 mol/L Triton X-100 内 10 min ， PBS 洗 2 次 ×3 min ；经 1% H2 O2 处理抑制内源性过氧化物酶，蛋白消化，终止消化后，切片放入 0.01 mol/L pH 6.0 柠檬酸缓冲液中，微波炉 Ⅲ 档（ 98 ℃ ）加热 10 min ，冷却， PBS 洗 3 次 ×3 min ，预杂交 2 h ， 42 ℃ ，不洗，在杂交液中加入多相寡核苷酸探针 4 μg/ml ， 20 μl/ 片，杂交 12~18 h ，上覆盖蜡膜防蒸发，湿盒内加入少量甲酰胺缓冲。杂交后 42 ℃ 柠檬酸缓冲液系列洗脱，再进行生物素化抗地高辛抗体信号放大检测， 0.04% DAB+0.03% H2 O2 ，显色 8~12 min ，苏木素衬染 30 s ，水洗，盐酸乙醇分化，水洗片刻，微波蓝化，常规树脂封片。观察心肌细胞核棕褐色者为阳性细胞。对照设计：阴性对照用不加探针的杂交液杂交，用 PBS 代替生物素化抗地高辛抗体，显示结果为阴性结果。阳性对照设计，以已知肺癌阳性切片做阳性对照。 1.2.5 图像分析 选择 200 倍视野，每张切片随机观察 5 个视野，按照一定的域值分割阳性细胞，利用分析软件计算每个视野中阳性表达的光密度值，然后计算平均值。再测定 c-fos 和 c-myc 表达的平均积分吸光度的阳性面积，并计算表达指数。表达指数 = （阳性面积值 × 光密度） /100 。 1.3 统计学方法 各组数据以 ` x s 表示，采用 SPSS 10.0 版软件进行统计分析，组间比较用单因素方差分析， P <0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 活血潜阳方对 SHR 左心室心肌组织 c-fos mRNA 及蛋白表达的影响 24 周龄 SHR 组左室心肌组织 c-fos mRNA 和蛋白的表达均高于同龄的 WKY 大鼠，差异有统计学意义（ P <0.01）。与模型组比较，西拉普利和各浓度中药均可降低 SHR c-fos mRNA 的表达（ P <0.05），但未达到正常大鼠水平（ P <0.05）。与模型组比较，西拉普利可降低 SHR 左室心肌组织 c-fos 蛋白的表达（ P <0.05），各个浓度中药对 c-fos 蛋白表达虽有下调，但与 SHR 模型组比较差异无统计学意义（ P >0.05）。见表 1 。
表 1 左心室心肌组织 c-fos 及 c-myc 的 mRNA 及蛋白表达指数
Table 1 Expression indexes of c-fos and c-myc mRNAs and proteins in left ventricular muscular tissues of SHRs
(` x s )
Group
n
C-fos mRNA
C-fos protein
C-myc mRNA
C-myc protein
Normal control
9
0.45±0.13△△
0.49±0.22△△
0.28±0.07△△
0.30±0.06△△
Untreated
9
2.12±0.60**
1.49±0.42**
2.85±0.36**
2.37±0.28**
Cilazapril-treated
9
1.16±0.38*△
0.79±0.14△
1.36±0.34*△
1.02±0.13*△
Low-dose HXQYF-treated
9
1.15±0.36*△
1.56±0.46*
1.45±0.31*△
2.02±0.26**
Medium-dose HXQYF-treated
9
1.04±0.30*△
0.97±0.33
1.12±0.14*△
0.95±0.15*△
High-dose HXQYF-treated
9
1.11±0.50*△
1.01±0.45
1.29±0.38*△
1.08±0.15*△
*P <0.05, **P <0.01 vs normal control group; △ P <0.05, △△ P <0.01 vs untreated group.2.2 活血潜阳方对 SHR 左心室心肌组织 c-myc mRNA 及蛋白表达的影响 免疫组化检测提示 24 周龄 SHR 左室心肌组织 c-myc mRNA 及蛋白表达高于同龄的 WKY 大鼠，差异有统计学意义（ P <0.01）；西拉普利组，中药大、中和小剂量组大鼠左心室心肌组织 c-myc mRNA 的表达低于模型组大鼠，差异有统计学意义（ P <0.05），但与 WKY 大鼠比较仍升高，差异有统计学意义（ P <0.05）；西拉普利组，中药大、中剂量组大鼠心肌组织中 c-myc 蛋白表达与模型组比较，差异有统计学意义（ P <0.05），小剂量中药对 SHR 左心室 c-myc 蛋白表达未见显著的影响。西拉普利组，中药大、中剂量组 3 组间作用未见统计学差异（ P >0.05）。见表 1 。
3 讨 论 所谓原癌基因（ proto-oncogene ）实际上是一类编码关键性调控蛋白的正常细胞基因，通常在成年分化组织细胞中不表达或有限表达，处于非激活状态，参与调控正常细胞的增殖和分化过程。当受某些理化因素刺激，被异常激活时，可出现结构、量或表达水平的异常，形成或促进某些病理状态的发生。即刻早期基因，是指原癌基因家族中能对药物、神经递质和激素引起的传入信息在数分钟内作出反应，进行表达的基因。 c-fos 和 c-myc 作为一核内蛋白类细胞癌基因，属即刻早期基因。
高血压 LVH 的心室重构涉及心肌细胞和间质胶原的重构，转基因动物和反义核酸技术均证明 c-fos 在心肌肥厚的信号传递过程中十分重要［ 6 -8 ］ ，随着年龄的增长，c-fos mRNA 在心肌组织的表达增多［ 9 ］ 。抑制c-fos mRNA 表达，可以抑制心肌细胞的肥大［ 10 ］ 。c-myc 不仅影响心肌细胞的重构，还参与细胞间质的重构。 Starksen 等［ 11 ］ 在实验中结扎大鼠主动脉和腹主动脉，在肥大心肌细胞中检测到c-myc 的表达， Jackson 等［ 8 ］ 也有相似发现。
祖国医学中无高血压左心室肥厚病名，根据临床表现，当属 “ 心悸 ” 、 “ 胸痹 ” 和 “ 眩晕 ” 等范畴。发病虽涉及心、肝、胆、脾、肾和气、痰、火等方面，但血瘀、阳亢、痰浊为大多患者的共同表现［ 12 ］ 。活血潜阳方（又名丹蛭降压方）由丹参、水蛭、钩藤、石决明等组成，具有活血化瘀、平肝潜阳和祛痰浊的作用。丹参为活血养血之良药；水蛭可破血逐瘀，加强丹参的活血化瘀之功；石决明能平肝潜阳、清肝明目；钩藤有熄风止痉、清热平肝功效，配石决明，共显平肝潜阳之效。佐以滋水涵木、健脾祛痰之药，共奏活血化瘀、平肝潜阳、祛痰湿之效。
由于高血压 LVH 不单纯是压力负荷的作用，所以改善和预防高血压 LVH 也不仅仅依赖降压治疗。我们用活血潜阳方，在临床研究中已发现虽然降压效果不强，却有改善左心室肥厚的作用［ 5 ］ 。既往实验发现，该方有改善SHR 左心室肥厚的作用［ 13 ］ 。本实验发现，24 周龄的 SHR 肥厚左室心肌原癌基因 c-fos 和 c-myc mRNA 及蛋白的表达均明显增强，活血潜阳方可以降低 c-fos mRNA 的表达，但其蛋白的表达虽有下降趋势，却未见统计学差异；活血潜阳方既可降低 c-myc mRNA 的表达，又可降低其蛋白表达。所以，我们认为对原癌基因 c-myc 表达的影响，是活血潜阳方改善高血压 LVH 的机制之一；而对 c-fos 的影响是否为活血潜阳方治疗左心室肥厚的作用机制尚不能确定。结合既往实验［ 5 , 13 ］ 结果，我们认为活血潜阳方改善高血压左心室肥厚的作用可能主要通过非压力负荷途径实现。
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.