RESPOSTA IN VITRO E SUSCETIBILIDADE AO AGROBACTERIUM DE DUAS CULTIVARES DE STYLOSANTHES GUIANENSIS¹

 

LUCIA VIEIRA HOFFMANN² e MARIA LUCIA CARNEIRO VIEIRA³

 

 

RESUMO - As cultivares Bandeirantes e Mineirão de Stylosanthes guianensis (Leguminosae) foram avaliadas quanto à capacidade de formação de brotos adventícios in vitro e quanto à suscetibilidade ao Agrobacterium. Para obter regeneração, foram utilizados vários tipos de explantes, e o meio basal MS foi suplementado com diferentes concentrações de ácido naftalenoacético (NAA) e 6-benzilanimopurina (BAP). Observou-se regeneração de brotos a partir de explantes cotiledonares e hipocotiledonares, nas duas cultivares. O Stylosanthes mostrou-se suscetível ao Agrobacterium selvagem, pois a formação de tumores foi induzida. Expressão transiente do gene uidA foi observada em tecidos infectados de Stylosanthes. Experimentos sobre a ação dos antibióticos cefotaxima e tetraciclina, usados em ensaios de transformação para eliminação do Agrobacterium, mostraram que a cefotaxima (250 µg mL^-1) tende a reduzir a regeneração de brotos em explantes da cv. Bandeirantes.

Termos para indexação: cultura de tecidos, leguminosa forrageira, transformação de plantas, expressão transiente.

 

IN VITRO RESPONSE AND AGROBACTERIUM SUSCEPTIBILITY OF TWO CULTIVARS OF STYLOSANTHES GUIANENSIS

ABSTRACT - Two Stylosanthes guianensis (Leguminosae) cultivars, Bandeirantes and Mineirão, were evaluated for their ability to form adventitious shoots in vitro and Agrobacterium susceptibility. To obtain regeneration, several explant sources were used and MS basal medium was supplemented with different concentrations of NAA and BAP. Shoot regeneration occurred in both cultivars from cotyledon and hypocotyl-derived tissues. Stylosanthes was susceptible to wild Agrobacterium strains, since tumor formation was induced. Transient expression of the uidA gene was observed on infected Stylosanthes tissues. Experiments on the effect of the antibiotic cefotaxime and tetracycline, used in transformation assays to Agrobacterium elimination, showed that cefotaxime (250 µg mL^-1) has a tendency to reduce shoot regeneration in cv. Bandeirantes explants.

Index terms: tissue culture, forage legume, plant transformation, transient expression.

 

 

INTRODUÇÃO

O gênero Stylosanthes (Leguminosae-Papilionoidea) é nativo do Brasil, onde mostra ampla distribuição geográfica e extensa variabilidade genética. Como planta forrageira, foi inicialmente introduzida na Austrália, onde se deu o desenvolvimento das primeiras cultivares de Stylosanthes guianensis e S. humilis (Hopkinson & Walker, 1984). Na América do Sul, o Stylosanthes guianensis é recomendado por ser adaptado a solos ácidos, deficientes em P e com elevados teores de Al. Segundo relatos de Ghisi et al. (1993) é também resistente à seca e sensível a baixas temperaturas.

Cultivares de S. guianensis têm sido selecionadas pela Embrapa, visando obter populações tolerantes à antracnose, principal limitação para plantio das cultivares australianas quando introduzidas no Brasil (Embrapa, 1993).

Uma das estratégias para a obtenção de plantas resistentes a patógenos ou com maior qualidade protéica é via transferência de genes exógenos, seguida da regeneração de brotos a partir dos tecidos transformados. A transformação de plantas vem sendo obtida em número crescente de espécies, e o método mais usado é o que utiliza o Agrobacterium como vetor de transferência de genes. Este processo é dependente da interação Agrobacterium-hospedeiro vegetal, da remoção da bactéria por um antibiótico e, ainda, do uso de marcadores seletivos (Barros et al., 1997). Antibióticos como cefotaxima e carbenicilina são utilizados para eliminação da bactéria em ensaios de transformação. Lavagens dos explantes infectados com tetraciclina são auxiliares nessa desinfecção. Segundo Sarma et al. (1995), estes podem, ocasionalmente, interferir na resposta in vitro dos explantes vegetais.

No caso do Stylosanthes, vários protocolos têm sido definidos visando à obtenção de brotos a partir do cultivo de diferentes explantes (Meijer & Szabados, 1991). A regeneração ocorre geralmente via calo (Silva, 1991; Dornelas et al., 1992), o que é indesejado, uma vez que este processo pode induzir o aparecimento de variantes somaclonais.

Os objetivos deste trabalho foram: 1. desenvolver protocolos para obter a regeneração de brotos adventícios, sem passagem por fase conspícua de calo, em duas cultivares de Stylosanthes guianensis; 2. verificar sua suscetibilidade ao Agrobacterium, e 3. caracterizar o efeito dos antibióticos cefotaxima e tetraciclina sobre a cultura de tecidos de S. guianensis.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

As cultivares de Stylosanthes guianensis utilizadas foram a Mineirão e a Bandeirantes, ambas desenvolvidas pela Embrapa-Centro de Pesquisa Agropecuária dos Cerrados (CPAC), que forneceu sementes para a realização deste estudo (Embrapa, 1993).

Obtenção dos explantes

Sementes da cv. Bandeirantes foram escarificadas por temperatura, mediante embebição em água a 80°C, por dez minutos. As sementes da cv. Mineirão foram escarificadas por temperatura ou manualmente (com pinça). Para esterilização, foram embebidas em etanol 70% (v/v) por 40 segundos, e a seguir, em solução de NaOCl 2% (v/v) por 8 minutos, sendo então lavadas quatro vezes em água destilada, deionizada e autoclavada. A germinação das sementes da cv. Bandeirantes ocorreu em meio MS (Murashige & Skoog, 1962) contendo a metade da concentração original de sais e compostos orgânicos (MS/2). As sementes da cv. Mineirão, escarificadas manualmente, germinaram em meio MS/6, e as escarificadas por temperatura, em MS/2. A germinação se deu seis dias após a inoculação.

Foram utilizados explantes derivados de hipocótilo, cotilédone, raiz e folha. Os explantes hipocotiledonares e cotiledonares foram excisados aos 16 dias após a infecção das sementes, enquanto os de raiz e folíolo, após 30 dias. Os explantes cotiledonares sofreram um corte transversal na sua base, enquanto os de folha, na base e na ponta. Ambos foram colocados com a superfície abaxial em contato com o meio de cultura. Os explantes de raiz derivaram de segmentos de cerca de 1 cm da raiz principal. Os explantes hipocotiledonares, denominados superior e inferior (segundo a sua orientação no seedling), foram obtidos cortando-se os hipocótilos ao meio, gerando segmentos de 1 cm.

Condições de cultivo e avaliação da resposta in vitro

Foram usadas, para cada um dos cinco tipos de explante, das duas cultivares, 20 combinações dos fitorreguladores BAP (6-benzilaminopurina) e NAA (ácido naftalenoacético): 0,0, 0,1, 0,5 e 2,0 mg L^-1 de NAA x 0,0, 0,1, 0,5, 1,0 e 2,0 mg L^-1 de BAP. Após adição dos reguladores de crescimento, o pH do meio foi corrigido para 5,8. Foram distribuídos 25 mL de meio em frascos de 120 mL de capacidade, os quais foram autoclavados a 120°C, durante 20 minutos. Inocularam-se três explantes/frasco, os quais foram mantidos sob 30 µE m² s^-1 de intensidade luminosa, à temperatura de 28±2°C e fotoperíodo de 16 horas. O número de repetições/tratamento foi igual a três (ou duas, quando houve perda por contaminação). Aos 28 dias, foi avaliado o número médio de brotos por explante por tratamento hormonal, procedendo-se a uma ANOVA em esquema fatorial (4 x 5). Avaliou-se também a porcentagem de explantes com regeneração.

Linhagens de Agrobacterium e vetor de transferência

Foram usadas sete linhagens selvagens para testar a suscetibilidade do Stylosanthes ao Agrobacterium (Tabela 1). Nos ensaios para avaliar a expressão transiente do gene uidA, foram utilizadas as linhagens desarmadas GV2260 (Deblaere et al., 1985) e GV3101 (Koncz & Schell, 1986), ambas derivadas da linhagem selvagem C58 e transformadas com o vetor pEA24, que contém o gene uidA (b-glucuronidase) sob controle do promotor 35S. Esse vetor foi cedido ao Departamento de Genética da ESALQ-USP pela Embrapa-Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genéticos e Biotecnologia.

 

 

Crescimento das bactérias e infecção dos explantes com linhagens selvagens

Uma colônia de Agrobacterium foi transferida para 10 mL de meio MYA (Tepfer & Casse-Delbart, 1987) e cultivada por 16 horas em mesa agitadora orbital (150 rpm), à temperatura 26±2°C. Uma alíquota de 1 mL foi transferida para meio fresco, permanecendo nas mesmas condições por seis horas, até atingir a densidade ótica de 0,8-1,0 a 660 nm (Mathis & Hinchee, 1994). A subcultura foi então centrifugada a 4.000 rpm, por oito minutos. O precipitado foi ressuspenso em NaCl 0,85% (p/v) contendo 40 µM de acetosyringone, ajustando a concentração final para 1 x 10⁹ bactérias/mL. A suspensão foi coletada em seringa esterilizada e usada para ferir o terço superior dos hipocótilos em ambos os lados, resultando em dez ferimentos/explante. Nesta etapa foi usada somente a cv. Bandeirantes.

Infecção dos explantes no ensaioda enzima ß-glucuronidase (uidA)

Foram inoculados de 15 a 20 explantes hipocotiledonares, em frascos (120 mL) contendo 5 mL de suspensão bacteriana, obtida conforme descrito anteriormente, porém substituindo NaCl 0,85% por MS líquido. Os frascos foram agitados a 60 rpm, por quatro a seis horas. Os explantes foram então transferidos para placas de Petri (9 cm) contendo meio MS, no qual permaneceram em co-cultivo por 48 horas, a 26°C. O excesso de meio líquido foi retirado dos explantes com papel filtro antes da transferência para meio sólido. O co-cultivo foi interrompido por duas lavagens dos explantes em solução de tetraciclina (50 mg L^-1), sob agitação a 160 rpm, por 30 minutos, seguidas de uma lavagem em água destilada e autoclavada (15 a 20 explantes/50 mL). Os explantes derivados da região superior dos hipocótilos da cv. Mineirão foram transferidos para MS + 0,1 mg L^-1 de BAP, enquanto os da região inferior foram transferidos para MS + 0,1 mg L^-1 de NAA + 0,5 mg L^-1 de BAP. Ambos os explantes da cv. Bandeirantes foram transferidos para MS + 0,5 mg L^-1 de BAP.

Para verificar a eficiência dos procedimentos de transformação adotados, foram realizados ensaios de expressão transiente do gene uidA, 48 horas após o término do co-cultivo. Os explantes foram colocados em tubo eppendorf e cobertos com 1 mL da solução composta de 1 mM de X-Gluc dissolvido em tampão 100 mM NaPO₄, pH 7,0; 10 mM EDTA, pH 7,0; 0,5 mM ferrocianeto de potássio; 0,5 mM ferricianeto de potássio e 0,1% Triton-X. Os tubos eppendorf foram colocados em banho-maria a 37°C, por 24 horas. Em seguida, a solução foi substituída por etanol 70% (v/v), para descoloração dos explantes (Stomp, 1992).

Efeito dos antibióticos cefotaxima e tetraciclina

Explantes excisados da região superior e inferior do hipocótilo das cvs. Bandeirantes e Mineirão foram submetidos aos seguintes tratamentos: i) controle: os explantes foram infectados em meio MS, livre de fitorreguladores, durante 48 horas, simulando o co-cultivo, e então transferidos para meio de regeneração, como descrito no ensaio de uidA; ii) tetraciclina: semelhante ao controle, porém antes da transferência para meio de regeneração foram efetuadas três lavagens em solução de tetraciclina a 50 µg mL^-1; iii) cefotaxima: semelhante ao controle, porém ao meio de regeneração foram adicionados 250 µg mL^-1 de cefotaxima, sendo que para a cv. Bandeirantes foi também avaliada a concentração de 100 µg mL^-1. Os dados relativos à freqüência de regeneração e número médio de brotos/explante foram coletados aos 28 dias.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As sementes da cv. Mineirão, escarificadas manualmente, apresentaram entumescimento e formação de calo na base dos hipocótilos, quando germinadas em MS/2. A partir desta observação, as sementes passaram a ser germinadas em MS/6, gerando explantes para os experimentos de cultura de tecidos. Sementes escarificadas pelo processo térmico forneceram explantes normais, em MS/2 ou MS/6.

O número médio de brotos regenerados por explante, em cada tratamento, está apresentado nas Tabelas 2 e 3. Foi mais uma vez comprovada a eficiência do fitorregulador BAP na formação de brotos, via organogênese, como é usual nas diferentes espécies de Stylosanthes (Vieira et al., 1990; Meijer & Szabados, 1991). As freqüências de regeneração, avaliadas pela porcentagem de explantes com gemas, foram semelhantes ou superiores às relatadas com relação a S. guianensis por Meijer & Broughton (1981) e Mesa et al. (1993).

 

 

 

Em meio MS, na ausência de reguladores de crescimento, explantes derivados de cotilédones e folíolos, de ambas as cultivares, apresentaram rizogênese, provavelmente devido à presença de auxina endógena. Os cinco tipos de explante das duas cultivares apresentaram rizogênese na dose zero de BAP quando na presença de NAA, em qualquer dose.

Em geral, não foi observada regeneração da parte aérea na ausência de reguladores de crescimento. Porém, explantes derivados de raiz e hipocótilo (segmento superior ou inferior) da cv. Mineirão apresentaram regeneração de brotos nesta condição. Nos demais explantes, a adição de BAP, combinada, ou não, com NAA, provocou aparecimento de brotos.

Os explantes derivados de folha foram os mais recalcitrantes em cultura, em ambas as cultivares. Ao contrário, os explantes hipocotiledonares foram os que responderam ao maior número de combinações de fitorreguladores (Tabelas 2 e 3). Na cv. Mineirão, explantes hipocotiledonares deram origem, em média, a 20,0 (segmento superior) e 16,7 (segmento inferior) brotos por explante, na presença de MS + 0,1 mg L^-1 de BAP e MS + 0,1 mg L^-1 de NAA + 0,5 mg L^-1 de BAP, respectivamente (Fig. 1a). Explantes hipocotiledonares foram igualmente responsivos em S. humilis (Meijer, 1982), S. scabra (Dornelas et al., 1991) e S. guianensis (Mesa et al., 1993).

 

 

A exemplo do que tem sido relatado na literatura (Dornelas et al.,1991; Meijer & Szabados, 1991; Silva, 1991), a regeneração de brotos se deu mediada por calo. Houve formação de brotos adventícios, sem passagem por calo conspícuo, a partir de explantes cotiledonares e hipocotiledonares, em ambas as cultivares. Esta resposta foi observada nos explantes cotiledonares da cv. Bandeirantes em MS + 0,1 mg L^-1 de BAP ou suplementado com 0,1 mg L^-1 de NAA e 0,1 mg L^-1 de BAP e a partir de explantes hipocotiledonares inoculados em MS + 0,5 mg L^-1 de BAP (Tabela 2).

Na cv. Mineirão, a adição isolada de 0,1 ou 0,5 mg L^-1 de BAP possibilitou a formação de brotos adventícios em 100% dos explantes hipocotiledonares (superiores); o mesmo foi observado em MS + 0,1 mg L^-1 de NAA + 0,5 mg L^-1 de BAP quanto a explantes derivados da região inferior dos hipocótilos dessa cultivar (Tabela 3). A regeneração sem passagem por calo conspícuo é desejada em cultura de tecidos, uma vez que desfavorece a incidência de variação somaclonal, que deve ser evitada quando se visa à transformação genética.

O aparecimento das primeiras gemas foi observado aos 21 dias de cultura, em todos os explantes da cv. Bandeirantes e nos cotilédones da cv. Mineirão. Em explantes derivados de hipocótilos e raízes da cv. Mineirão, a regeneração ocorreu mais precocemente, aos 14 dias, e em explantes derivados de folíolo, mais tarde, aos 28 dias de cultura.

As combinações hormonais que induziram maior número médio de brotos por explante foram aquelas nas quais houve 100% de regeneração, exceto em explantes oriundos dos hipocótilos inferiores da cv. Bandeirantes. Na combinação MS + 0,1 mg L^-1 de NAA + 0,5 mg L^-1 de BAP, 83,3% dos explantes mostraram regeneração, e cinco brotos por explante, em média, foram observados (Tabela 2).

Nos explantes infectados com as várias linhagens selvagens de Agrobacterium tumefaciens observou-se a formação de tumores (Fig. 1b), os quais não ocorreram nos tecidos controle (Tabela 4). No caso da infecção com linhagens selvagens de A. rhizogenes, observou-se igualmente a formação de tumores e de raízes em cabeleira (Weising & Kahl, 1996). É possível que esse sintoma se deva à ação combinada dos genes iaaM e iaaH, presentes no plasmídeo R_i, com o teor endógeno de citocinina dos explantes infectados.

 

 

As linhagens A208 e 8196 foram superiores quanto à capacidade de induzir a formação de tumores (ensaio A). Da mesma forma, as linhagens A4 e A4T, esta na presença, ou não, de 40 µM de acetosyringone, mostraram-se superiores (ensaio B). A infecção do tecido vegetal com a linhagem C58 (40 µM de acetosyringone) induziu a maior formação de brotos por explante (Tabela 4).

O aparecimento de brotos adventícios nos locais de ferimento foi observado cerca de 20 dias após o ferimento dos explantes com seringa contendo a cultura de Agrobacterium selvagem. Esses brotos surgiram também nos controles. A formação espontânea de brotos nos locais de ferimento foi igualmente relatada em plantas transformadas com o gene ipt de A. tumefaciens, que induz superexpressão de citocininas (Binns, 1994). Essa tendência foi observada por Gloria & Estelita (1995), em espécies brasileiras de cerrado, Mandevilla illustris e M. velutina.

Os brotos formados a partir dos explantes infectados com linhagens selvagens puderam ser excisados e mantidos livres de contaminação pelo Agrobacterium (os inóculos permaneceram restritos à região de ferimento). Cerca de 22% deles (oriundos de explantes infectados com a linhagem A4) apresentaram formação de calo e raízes na parte aérea, alterações essas semelhantes às causadas pela ação de oncogenes (Fig. 1c). A brotação induzida diretamente pela infecção de tecidos vegetais com linhagens selvagens de Agrobacterium tem sido apontada como vantajosa em relação aos métodos usuais de transferência de genes, que requerem passagem por cultura e o uso de antibióticos (Brasileiro et al., 1991). Além disso, estudos histológicos têm mostrado que uma das limitações da metodologia de transformação mediada pelo Agrobacterium é obter células transformadas com capacidade de regeneração de brotos.

Explantes derivados de hipocótilos mostraram pontos azuis resultantes da expressão do gene uidA (Fig. 1d-e). A freqüência de explantes uidA-positivos foi de 100% na cv. Bandeirantes e de 91% na cv. Mineirão.

Os explantes tratados com tetraciclina ou cefotaxima foram comparados aos controles, com o objetivo de verificar se estes antibióticos são prejudiciais à regeneração. Não foram detectadas diferenças significativas no que se refere às porcentagens de regeneração e número médio de brotos por explante, aos 28 dias de cultura, em todos os tratamentos (Tabela 5). A lavagem em tetraciclina é auxiliar na eliminação das bactérias. Embora não significativo, o tratamento com cefotaxima a 250 µg mL^-1 reduziu as freqüências de regeneração a zero (P=0,14) em explantes hipocotiledonares da cv. Bandeirantes. Por isso, recomenda-se a dose de 100 µg mL^-1. A cv. Mineirão mostrou-se tolerante à presença da cefotaxima (Tabela 5).

 

 

A cefotaxima atua em cultura de modo similar a uma auxina (Sarma et al., 1995), e sua toxicidade pode ser atribuída a este efeito (Lin et al., 1995). Aparentemente, devem-se a essa ação a formação mais conspícua de calo e a redução da capacidade de regeneração de brotos, observadas na cv. Bandeirantes.

 

CONCLUSÕES

1. As cultivares Bandeirantes e Mineirão de Stylosanthes guianensis mostram regeneração de brotos adventícios a partir da cultura de explantes hipocotiledonares em meio suplementado com BAP.

2. O Stylosanthes guianensis é suscetível à infecção por linhagens selvagens e transformadas de Agrobacterium.

3. A lavagem em tetraciclina não prejudica o desenvolvimento dos explantes de Stylosanthes guianensis em cultura, e é auxiliar na eliminação do Agrobacterium.

4. A adição do antibiótico cefotaxima na dose 250 µg mL^-1 causa redução na capacidade de regeneração em explantes da cv. Bandeirantes, porém é tolerada pela cv. Mineirão.

 

AGRADECIMENTOS

Ao biólogo Carlos Alberto de Oliveira, pelo apoio técnico; ao M.Sc. Luciano Cônsoli, pelas sugestões durante a condução dos ensaios de transformação; aos pesquisadores da Embrapa, M.Sc. Claudio Karia (Embrapa-CPAC) e Dr. Eugen Gander (Embrapa-Cenargen), pela cessão das sementes de Stylosanthes e do vetor pEA24, respectivamente.

 

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¹ Aceito para publicação em 27 de abril de 1999.
² Eng. Agrôn., M.Sc., Dep. de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz" (ESALQ), Universidade de São Paulo (USP), Caixa Postal 9, CEP 13400-970 Piracicaba, SP.
³ Biól., Dra, Livre Docente, Dep. de Genética, ESALQ-USP.
E-mail: mlcvieir@carpa.ciagri.usp.br