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INVESTIGACIÓN CLÍNICA

 

Polimorfismos genéticos de APOA5 se asocian a hipertrigliceridemia e hiperglicemia en individuos chilenos con enfermedad coronaria y controles

Genetic polymorphisms of APOA5 are associated with hypertriglyceridemia and hyperglycemia in Chilean subjects with coronary artery disease and controls

 

Nicolás Saavedra^1,2, Alejandro Cuevas^1,2, Alfonso Hernández^1,2, José Caamaño^1,2, Priscilla Jaramillo^1,2, Fernando Lanas^2,3, Luis A. Salazar^1,2

¹Laboratorio de Biología Molecular y Farmacogenética, Departamento de Ciencias Básicas; ²Núcleo de Desarrollo Científico - Tecnológico en Biorecursos (BIOREN), ³Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

Dirección para correspondencia

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Resumen

Introducción: Diversas variantes genéticas han sido relacionadas al desarrollo de enfermedad coronaria y/o sus factores de riesgo; entre ellas, los polimorfismos S19W y -1131T>C del gen que codifica para la apolipoproteína A5 (APOA5). Así, el objetivo del presente estudio fue investigar la posible asociación entre las variantes S19W y -1131T>C del gen APOA5 y enfermedad coronaria en individuos chilenos.

Métodos: Se evaluaron 425 sujetos adultos, no relacionados; 209 pacientes con enfermedad coronaria (EC) comprobada por angiografía (estenosis→ 70%), con edades entre 33 y 74 años, y 216 individuos controles (30 a 68 años). La genotipificación de los polimorfismos S19Wy -1131T>C del gen APOA5 fue realizada mediante la técnica de PCR-RFLP

Resultados: La distribución de los genotipos para el polimorfismo S19W del gen APOA5 en el grupo casos (SS: 80%, SW: 19% y WW: 1%) y en el grupo control (SS: 82%, SW: 17% y WW: 1%) fue semejante (p=NS). La distribución genotípica para el polimorfismo -1131T>C en pacientes con EC (TT: 56%, TC: 37%, y CC: 7%) y controles (TT: 63%, TC: 30% y CC: 7%) fue similar (p=NS). Las ORs relacionadas a los alelos mutados 19W (1.12; I.C.95%, 0.72- 1.74, p=NS)y-1131C (1.19; I.C.95%,, 0.87- 1.63, p=NS), confirman la ausencia de asociación. Por otro lado, las concentraciones de triglicéridos y glucosa en ayunas fueron significativamente más elevadas en los sujetos portadores de los alelos 19Wy -1131C, tanto en casos como en controles (p<0.05). Conclusión: La asociación observada entre las variantes genéticas de APOA5 y las altas concentraciones séricas de triglicéridos y glucosa, en ambos grupos, sugiere que estos polimorfismos podrian contribuir al desarrollo de la dislipidemia diabética; un reconocido factor de riesgo para enfermedad arterial coronaria.

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Background: Several genetic variants have been linked to the development ofcoronary heart disease and/or their riskfactors, including the S19Wand-1131T> C polymorphisms ofthe gene that encodes apolipoprotein A5 (APOA5). Thus, the objective ofthis study was to investígate the possible association between S19W and -1131T>C genetic variants ofAPOA5 and coronary disease in Chilean individuáis.

Methods: We evaluated 425 not related subjects; 209 patients with coronary artery disease (CAD) confirmed by angiography (stenosis→ 70%,), aged between 33 and 74 years, and 216 control individuáis (30 to 68 years). The genotyping of S19W and -1131T>C polymorphisms of APOA5 gene was evaluated by PCR-RFLP. Results: The genotype distríbution of S19W polymorphism of APOA5 gene in CAD patients (SS: 80%,, SW: 19%, WW: 1 %>) and controls (SS: 82%,, SW: 17%, WW: 1 %>) was similar (p = NS). In the same way the genotype distríbution of-1131T>C genetic variantin CAD subjects (TT: 56%,, TC: 37%,, and CC: 7%>) and controls (TT: 63%,, TC: 30%, and CC: 7%o) was equivalent (p = NS). The Odds ratios related to the mutant alleles 19W (1.12, 95%, Cl, 0.72 - 1.74, p = NS) and -1131C (1.19, 95%, Cl, 0.87 -1.63, p = NS) confirms the absence of association. On the otherhand, the triglycerides and fasting glucose concentrations were significantly higher in subjects carrying the alleles 19W and -1131C, in both groups, CAD patients and controls (p <0.05).

Conclusion: The observed association between genetic variants of APOA5 and higher serum levels of triglycerides and glucose, in both groups, suggesting that these polymorphisms could be contribute to the development ofdiabetic dyslipidemia, a known risk factor for coronary artery disease.

Key words: Coronary artery disease; APOA5 gene; Cardiovascular risk factors

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Introducción

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) se han convertido en un importante problema de salud pública en las últimas décadas, siendo responsables, en el año 2000, del 31% de la totalidad de las muertes en Latinoamérica¹. En nuestro país, la mortalidad asociada a ECV es del orden de un 28%, siendo la principal causa de muerte. Además, un 55% de la población tiene riesgo de padecer una patología de este tipo, de acuerdo con la encuesta nacional de salud del año 2003 (Ministerio de Salud).

Diversos factores han sido relacionados al origen de la enfermedad coronaria (EC), entre éstos la hipertrigliceridemia. Estudios epidemiológicos muestran que los triglicéridos (TG) aumentados son un factor de riesgo independiente de EC^2,3. Debido a la complejidad de la hipertrigliceridemia, existen varios orígenes posibles para este desorden, incluyendo causas secundarias como el alcoholismo, la diabetes mellitus y la obesidad. Actualmente, con la ayuda de técnicas moleculares se ha observado que los factores genéticos tienen un papel importante en el metabolismo y regulación de los triglicéridos. Así, diversos genes candidatos han sido investigados, entre ellos el gen que codifica para la apolipoproteína A-V (APO AV).

La apo A-V fue identificada en el año 2001, simultáneamente por dos grupos de investigadores^4,5. Se compone de 366 aminoácidos, se produce en el hígado y es codificada por el gen APOA5 que se encuentra íntimamente asociado al locus AI/CIII/AIV, en el cromosoma 11 q23. Esta apoliproteína está fuertemente asociada al metabolismo de los triglicéridos, pues se ha detectado en VLDL, HDL y quilomicrones⁵,⁶. Es importante destacar que la alteración de la concentración de estas lipoproteínas también se relaciona con EC.

Estudios en ratones transgénicos revelaron que una sobreexpresión de apo A-V humana causa una disminución de los niveles de triglicéridos y HDL-colesterol, mientras que en ratones knockout para este gen, los TG aumentan⁷, dejando en evidencia el importante rol de la apo A-V en el metabolismo lipídico. Se cree que el mecanismo por el cual interviene, es mediado por un aumento de la actividad de la lipoproteínlipasa (LPL)⁸ o mediante interacción con proteogl¡canos que atan LPL en la superficie celular ⁹, aumentando la lipólisis de las VLDL y disminuyendo así, la concentración de TG en ellas (Figura 1). También se ha sugendo que apo A-V podría aumentar el aclaramiento de las VLDL, posiblemente asociado a una disminución de apo B y apo Clll, y de esta forma disminuir el nivel postprandial de triglicéridos¹⁰.

Diversas variantes del gen APOA5 han sido asociadas al aumento de los niveles séricos de triglicéridos en diferentes poblaciones. Entre éstas, las dos más estudiadas son: -1131T>C (región promotora) y c.56 G>C (S19W) ^11-14. La presencia de estos polimorfismos se han asociado a una disminución de la expresión del gen APOA5, lo que condicionaría un aumento en los niveles de triglicéridos^15,16, y a una mayor predisposición a padecer diabetes mellitus tipo 2¹⁷; ambos factores de riesgo reconocidos de enfermedad coronaria.

Varios estudios realizados en poblaciones de origen oriental y europea, han demostrado una asociación importante entre EC y los polimorfismos mencionados^18-21.

Sin embargo, esta asociación no ha sido confirmada por todos los autores²², existiendo aún discrepancias al respecto.

Así, el objetivo del presente trabajo fue investigar la posible asociación entre las vanantes S19Wy -1131 T>C del gen APOA5 y enfermedad coronaria en individuos chilenos.

Material y métodos

Sujetos de estudio

El presente estudio analizó un total de 425 sujetos adultos no relacionados; 209 individuos con diagnóstico de enfermedad arterial coronaria (historia y ECG de infarto al miocardio o enfermedad coronaria comprobada por angiografía con estenosis superior al 70%), provenientes del Hospital Hernán Henríquez Aravena de la ciudad de Temuco. Por su parte, el grupo control quedó integrado por 216 individuos sin enfermedad coronaria, verificada por la ausencia de angina y electrocardiograma sin evidencias de isquemia o infarto; todos provenientes de la IX Región de La Araucanía.

En este estudio, hipertensión arterial fue definida como los valores medidos de presión arterial sistólica→ 140 mm Hg y/o presión arterial diastólica ≥ 90 mm Hg o en uso de tratamiento antihipertensivo. Diabetes mellitus fue definida tras la medición de glucosa en ayunas y obtención de valores ≥ 126 mg/dl (7 mmol/l) o en uso de tratamiento hipoglicemiante. Hipercolesterolemia fue definida por valores de colesterol total ≥ 240 mg/dl en ayunas. La presencia de tabaquismo fue definida como ex - fumadores y fumadores habituales. Mediante encuesta escrita, se obtuvieron también datos de sus hábitos alimentarios, consumo de bebidas alcohólicas e historia familiar de enfermedad cardiovascular precoz (parientes de primer grado < 55 años para hombres y < 65 años para mujeres).

Todos los individuos incluidos en este estudio aprobaron su participación mediante la firma de un consentimiento informado, el cual fue previamente aprobado por el Comité de Ética Científica del Servicio de Salud Araucanía Sur (Temuco, IX Región de La Araucanía).

Determinaciones bioquímicas

Para las determinaciones de laboratorio se obtuvieron muestras de sangre venosa sin anticoagulante, previo ayuno de 12 horas. La concentración de colesterol total y triglicéridos fue determinada por métodos enzimático-colorimétricos^23,24; el colesterol HDL-C se midió previa precipitación selectiva de las LDL y VLDL con ácido fosfotúngstico e iones magnesio y posterior determinación por el método CHOD-PAP²⁵; la concentración de colesterol de las LDL (LDL- C) fue calculada mediante la formula de Friedewald²⁶.

Las concentraciones séricas de glucosa y ácido úrico fueron determinadas mediante métodos enzimático-colorimétricos²⁷²⁸.

Genotipificación de las variantes -1131T>C y S19W del gen APOA5

El ADN genómico fue extraído a partir de sangre total anticoagulada con EDTA mediante la técnica de precipitación salina descrita por Salazar et al.²⁹. Para el estudio de las variantes -1131T>C y S19W se amplificaron fragmentos de 154 y 157 pares de bases (bp), respectivamente, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en un termociclador MyCycler (Bio-Rad, California, EE.UU.) usando partidores previamente descritos³⁰.

El protocolo de PCR utilizado fue: 200 nM de cada primer, dNTPs 0,2 nM, cloruro de magnesio (MgCI₂) 2  mM, 1 U de Taq Polimerasa (Fermentas, Lituania), buffer 1X, ~ 200 ng de ADN y agua destilada estéril, para un volumen final de 50 µL. La mezcla de reacción se sometió a una denaturación inicial a 98° C durante 3  minutos y 30 ciclos compuestos por denaturación de 1 minuto a 95° C, hibridación por 1 minuto a 58° C (-1131 T>C) o 62°C (S19W), y una fase de extensión de 1 minuto a 72° C, seguidos de una extensión final de 10 minutos a 72° C. El producto amplificado se evaluó en gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio (0.5mg/L) y visualizado en un sistema de fotodocumentación digital, E-Box 1000 (Vilber Lourmat, Francia).

Los productos de amplificación fueron sometidos a digestión enzimática utilizando las endonucleasas FastDigest Taq\ para S19W y Tru1\ para -1131 T>C (Fermentas, Lituania), obteniendo para el alelo T de la variante -1131, dos fragmentos (133 y 21 bp) y un único fragmento (154bp) para el alelo C. En cuanto a la variante S19W, se obtuvo dos fragmentos para el alelo S (134 y 23bp) y un único fragmento para el alelo W (157bp). Los productos de restricción fueron evaluados mediante electroforesis en gel de agarosa al 3%.

Control de calidad de las determinaciones bioquímicas y moleculares

La exactitud de las determinaciones bioquímicas fue controlada mediante la utilización de sueros comerciales normales y patológicos (Human, Alemania). La posibilidad de contaminación en los análisis moleculares fue excluida por la utilización de controles de reactivos en cada serie de amplificación. La correcta genotipificación de los polimorfismos del gen APOA5 fue confirmada mediante la repetición al azar del 10% de los análisis previamente realizados. La concordancia encontrada fue de 100%.

Análisis estadístico

El análisis de los datos obtenidos se realizó utilizando el programa SigmaStat para Windows, versión 2.0 (San Rafael, CA, EE.UU). Todas las variables continuas se expresan como media ± desviación estándar. La asociación entre las variables analizadas fue comprobada mediante el test f de Student. Además, se utilizó el test de Chi - cuadrado (x²) para el análisis de las variables no continuas y para verificar el equilibrio Hardy - Weinberg. Las Odds ratios (ORs) y sus respectivos intervalos de confianza (I.C) de 95%, asociadas a los alelos mutados (19Wy -1131C) fueron también calculadas. El nivel de significancia estadística considerado en este estudio fue p < 0.05.

Resultados

Características de los sujetos

Las características clínicas, demográficas y de laboratorio de los individuos evaluados en este estudio se resumen en la Tabla 1. Como puede ser comprobado, se encontraron diferencias significativas entre los grupos investigados en relación a las concentraciones séricas de colesterol total, LDL-C, HDL-C, triglicéridos, ácido úrico y glucosa (p<0.001). Entre los parámetros clínicos, se observó que los individuos con EC presentaron valores de presión arterial sistólica y diastólica mayores que el grupo control (p<0.05).

Además, la presencia de diabetes mellitus tipo 2, hipercolesterolemia, consumo de tabaco, hipertensión arterial, IAM e historia familiar de EC fue significativamente mayor en los pacientes con EC (p < 0,001).

Análisis de los polimorfismos del gen APOA5

La distribución genotípica y la frecuencia relativa de los alelos para los polimorfismos del gen APOA5 son mostradas en la Tabla 2.

La distribución de los genotipos para el polimorfismo S19Wen el grupo casos (SS: 80%, SW: 19% y WW: 1 %) y en el grupo control (SS: 82%, SW: 17% y WW: 1%) fue semejante (p=NS). La distribución genotípica para el polimorfismo -1131T>C en pacientes con EC (TT: 56%, TC: 37%, y CC: 7%) y controles (TT: 63%, TC: 30% y CC: 7%) fue similar (p=NS). Las ORs relacionadas a los alelos mutados 19W(1.12; I.C.95%, 0.72 — 1.74, p=NS) y -1131C (1.19; I.C.95%, 0.87 — 1.63, p=NS), confirman la ausencia de asociación.

Por otro lado, las concentraciones de triglicéridos y glucosa en ayunas fueron significativamente más elevadas en los sujetos portadores de los alelos 19W y -1131C, tanto en casos como en controles (p<0.05, Tablas 3 y 4).

Discusión

Diversas investigaciones han demostrado que las ECV poseen un importante componente genético³¹. Sin embargo, en nuestro país, aún son escasos los trabajos relacionados a este tema^32-36. En el presente estudio fue evaluada, por primera vez en Chile, la frecuencia de los polimorfismos S19Wy -1131T>C del gen APOA5 y su posible contribución al desarrollo de EC en individuos de la IX Región de La Araucanía.

Al analizar las características bioquímicas de los individuos incluidos en este estudio, se encontraron concentraciones séricas de colesterol, LDL-C, triglicéridos, glucosa y ácido úrico significativamente más elevadas en el grupo casos al ser comparadas con el grupo control. Por otra parte, los valores de HDL-C fueron significativamente más bajos en los pacientes con enfermedad coronaria que en controles. Además, la presencia de factores de riesgo clásicos de EC fue significativamente mayor en los pacientes con EC.

El análisis molecular demostró que no existe asociación directa entre las variantes del gen APOA5 investigadas y enfermedad coronaria en los sujetos evaluados. La frecuencia de los alelos mutados fue similar entre casos y controles (p>0.05). Resultados semejantes fueron observados por Martinelli et al.²² en población italiana, quienes no encontraron evidencias de asociación entre los polimorfismos S19W, -1131 T>C y la presencia de EC confirmada por angiografía en 669 sujetos. Por otro lado, diversos autores han relacionado estos polimorfismos con mayor susceptibilidad de desarrollar enfermedad coronaria en diferentes poblaciones^18-21. Existen diversas razones que pueden explicar estas discrepancias, entre éstas podemos mencionar: el diseño del estudio, la definición de los criterios de inclusión y exclusión, el número de individuos, y por supuesto la etnia de los sujetos evaluados³⁷.

Sin embargo, al evaluar la posible asociación entre los diferentes genotipos de las variantes investigadas y las concentraciones séricas de lípidos y glucosa en los individuos con enfermedad arterial coronaria y controles, se observó que los portadores de los alelos mutados 19W y -1131C presentaron niveles más elevados de triglicéridos y glucosa comparado a los portadores de los alelos normales. Similarmente, diversos autores han observado también estas asociaciones^22,38,39. Además, estas variantes genéticas han sido relacionadas con síndrome metabólico y diabetes mellitus tipo 2; todos factores de riesgo indiscutidos de enfermedad coronaria^40,41.

En resumen, nuestro estudio muestra que los polimorfismos S19W y -1131T>C del gen APOA5 no están asociados directamente a enfermedad coronaria en la población analizada. Sin embargo, estas variantes fueron relacionadas a niveles séricos más elevados de triglicéridos y glucosa, en ambos grupos; hallazgo que sugiere que estos polimorfismos pueden contribuir al origen de la dislipidemia diabética, un reconocido factor de riesgo de enfermedad arterial coronaria.

 

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Trabajo financiado por FDI-MINEDUC & DIUFRO DI09-2012, Dirección de Investigación y Desarrollo, Universidad de La Frontera.

Recibido el 19 de Noviembre de 2008, Aceptado el 1 de Marzo de 2010

Correspondencia: Dr. Luis Antonio Salazar Departamento de Ciencias Básicas Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera Av. Francisco Salazar 01145 Casilla 54-D, Temuco. Fono: 45-592895 - Fax: 45 - 592832 Correo Electrónico: lsalazar@ufro.cl