Liu S, Song XY, Wu CY, Han XH, Liu LL, Liu JW, Xu YC. J Chin Integr Med. 2010; 8(9): 877-882. Received March 5, 2010; accepted May 5, 2010; published online September 15, 2010. Indexed/abstracted in and full-text link-out at PubMed. Journal title in PubMed: Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. Free full text (HTML and PDF) is available at http://www.jcimjournal.com.  Forward linking and reference linking via CrossRef. DOI: 10.3736/jcim20100912

Correspondence: Sheng Liu, MD, Professor; Tel: 021-64385700-6407; E-mail: yige823@163.com

基金项目: 国家自然科学基金资助项目(No. 30772811); 上海市教育委员会“曙光跟踪”资助项目(No. 08GG12)

     乳腺癌是严重威胁妇女健康和生命的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升并已列居女性恶性肿瘤的首位^［1］。随着放、化疗水平的提高，原发灶的治疗方法已经成熟，防治乳腺癌术后的复发转移成为研究的热点^［2］。乳腺癌细胞血液转移最常见的转移部位为骨、肝、肺，其中骨转移的发生率为65%～75%，远高于其他部位^［3］，可能是骨髓微环境为乳腺癌细胞提供了一个有利于生长、侵袭、转移和逃逸免疫攻击的场所^［4］。中医学认为乳腺癌骨转移的病机包括正虚和邪实两方面，其中正虚为肾阳虚，邪实为癌毒。癌毒蚀骨，骨弱癌毒浸润，形成恶性循环，使病情日益严重。由于半数以上乳腺癌患者存在骨量减少或骨质疏松症^［5］，故在乳腺癌患者早期治疗中，坚骨显得尤为重要，骨充则癌毒侵袭无力，可预防乳腺癌骨转移的发生发展。补骨脂和蛇床子作为药对使用在古文献中早有记载，如宋代《太平圣惠方》卷九十八“补骨脂丸”中以补骨脂和蛇床子相伍，共济补肾壮阳、强力健肌之效。近代《北京市中药成方选集》“法制黑豆方”中以补骨脂配蛇床子补肾益精，强筋壮骨，二药相须为用，增强补肾之功效。实验研究发现，补骨脂和蛇床子提取物可以抑制乳腺癌细胞的增殖^［6-8］，促进成骨细胞的分化，提高成骨细胞碱性磷酸酶的活性^［9-11］。本研究用不同比例蛇床子和补骨脂药物血清培养乳腺癌细胞MDA-MB-231BO和骨髓基质细胞ST2，以确定温肾药蛇床子和补骨脂抑癌、坚骨的最佳配伍比例关系并指导临床。

1  材料与方法
1.1  实验材料
1.1.1  实验试剂  胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品；茜素红，上海生工生物工程有限公司产品；对硝基苯磷酸二钠(4-nitrophenyl phosphate disodium salt，PNPP)、甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、台酚蓝和二乙醇胺（diethanolamine，DEA），美国Sigma公司产品；二甲基亚砜和Trition X-100溶液，国药集团化学试剂有限公司产品；多聚甲醛，上海凌峰化学试剂有限公司产品；达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM），美国Gibico公司产品。
1.1.2  实验器材  XSP-17C倒置生物显微镜，上海长方光学仪器有限公司生产；可调移液器，芬兰Labsystems公司生产；SW-CJ-1FD超净工作台，上海博迅实业有限公司生产；台式高速冷冻离心机，Sigma公司产品；BB5060 CO2培养箱，美国Thermo公司生产。
1.1.3  实验药物  中药蛇床子和补骨脂由上海龙华医院药剂科提供，除空白组其余各组总药物量均为200 g，按照中医传统方法煎制。以蛇床子和补骨脂1︰1配伍组为例，用蛇床子100 g和补骨脂100 g，加水2 000 mL浸泡1 h后武火煮沸15 min，文火煮沸30 min，再次加水1 000 mL煎煮，反复3次后合并3次煎液，浓缩至100 mL，冷藏备用。灌胃时分别给予煎液12.5 mL/kg，相当于生药用量25 g/kg。
1.1.4  细胞株和实验动物  亲骨性乳腺癌高转移细胞株MDA-MB-231BO，由日本大阪大学口腔医学研究院生物化学系馈赠；骨髓基质细胞株ST2，由山东大学遗传研究所馈赠。两细胞株均用含有50 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素、10%胎牛血清的DMEM，在37 ℃，5% CO2条件下培养。雌性SD大鼠36只，SPF级，2～3月龄，体质量200～250 g，购于复旦大学动物实验中心，合格证号为SCXK(沪)20070002。
1.2  实验方法
1.2.1  实验动物分组及药物血清的制备  36只大鼠依据随机数字法分为蛇床子和补骨脂用药比例4︰0组、3︰1组、1︰1组、1︰3组、0︰4组和空白组，每组6只。大鼠给药剂量为人鼠等效剂量的5倍，即每组灌胃生药量为25 g/kg，空白组予等体积生理盐水灌胃，每日2次。连续给药3 d后，第3天晚上禁食不禁水，于第4天给药1～1.5 h后，2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，无菌离心管收集，室温下静置2 h，2500 r/min（离心半径16.1 cm）离心25 min。提取同组血清合并，在56 ℃，30 min灭活补体，经0.22 μm微孔滤膜过滤，分装，－20 ℃保存备用。
1.2.2  MTT法检测MDA-MB-231BO和ST2细胞抑制率  取状态良好的细胞，胰酶消化，以DMEM为培养基，台酚蓝染色，将细胞浓度调整至1×105个/mL，以每孔0.2 mL铺于96孔板。镜下观察当细胞长至70％融合后，吸弃培养基，PBS冲洗两次，在治疗组各孔内加入体积分数为10%的含药血清100 μL，并以10%空白血清100 μL作对照。培养24 h后吸弃培养基，加入100 μL MTT(5 g/L)继续培养4 h。去上清液，加100 μL的二甲基亚砜，振荡10 min，在酶标仪上检测（以630 nm为参考波长）492 nm波长处的光密度（optical density，OD）^［12］。细胞抑制率计算公式为：抑制率(%)=(空白组OD均值－实验组OD均值)/空白组OD均值×100。
1.2.3  MDA-MB-231BO肿瘤细胞迁徙实验  参照杨靖亚等^［13］的方法进行。取MDA-MB-231BO细胞，台酚蓝染色，1×10⁵个/mL接种于24孔板，每孔1 mL，置37 ℃、5％ CO2、饱和湿度的培养箱培养。细胞完全融合后，用细胞刮在培养板中央区域造一道划痕，目镜测微尺(用镜台测微尺校正)测量划痕宽度后每孔加入10%不同比例的含药血清处理，每比例平行3孔，空白组加等体积的空白血清。孵育48 h后用目镜测微尺测量划痕宽度，均取最宽距离。实验重复3次，取平均值。细胞迁移的距离=药物处理前的划痕宽度－药物处理后的划痕宽度。
1.2.4  ST2细胞碱性磷酸酶活性检测  ST2细胞具有合成、分泌ALP的功能。将培养的ST2细胞以1×10⁵个/mL的密度接种于24孔培养板,每孔900 μL，于37 ℃、5% CO²培养箱中培养。经过24 h细胞贴壁后，各实验组更换为不同比例的含药血清，继续培养48 h后吸弃上清液，用PBS洗涤2次，加入100 μL 0.1%的Trition X-100溶液，放置在－20 ℃冰箱中反复冻融2次以后全裂解细胞。将细胞裂解液按100 μL/孔转入96孔酶标板中，加入3×10^－3 mol/L PNPP溶液及DEA溶液各50 μL，于37 ℃温箱内反应30 min后，每孔加入0.2 mol/L的NaOH 50 μL终止反应，于酶标仪405 nm处测定OD值^［14］。
1.2.5  ST2细胞矿化结节形成能力的检测  ST2细胞矿化结节的形成代表了成骨细胞增殖成熟和成骨的功能。每个矿化结节为1个具有形成结节功能的成骨细胞经一定时期的增殖而形成。将1×10⁵个/mL ST2细胞1 mL接种于24孔板内，第2天更换不同比例含药物血清的培养液，以后每3天更换培养液一次，连续观察15 d。吸去培养液，PBS冲洗，多聚甲醛固定10 min，PBS洗2次，加入0.1％茜素红染色液30 min^［15］后在倒置显微镜下观察，以红染、边界清晰、短径大于100 μm为矿化结节形成标准，小于100 μm不予计算，100倍光学显微镜下对整个孔计数，拍照。
1.3  统计学方法  数据用x±s表示。所有数据采用Origin 7.0统计软件进行处理分析，采用t检验或多个样本单因素方差分析作组间两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果
2.1  不同比例蛇床子与补骨脂的含药血清对MDA-MB-231BO细胞增殖的影响  与空白组含药血清比较，蛇床子和补骨脂1︰1和3︰1配伍组含药血清对MDA-MB-231BO细胞的生长有明显抑制作用，其中1︰1组较强，抑制率为16.63%，差异有统计学意义(P<0.05)；蛇床子和补骨脂4︰0、1︰3、0︰4配伍含药血清对肿瘤细胞无明显抑制作用(P>0.05)。见图1。

图1  不同比例蛇床子和补骨脂含药血清对MDA-MB-231BO细胞的抑制率
Figure 1  Inhibition rates of MDA-MB-231BO cells by sera containing different proportions of Fructus Cnidii and Psoralea corylifolia
Data were represented as x±s, n=3. *P<0.05, vs control group.

2.2  不同比例蛇床子和补骨脂的含药血清对ST2细胞增殖的影响  与空白组比较，蛇床子和补骨脂0︰4配伍组含药血清对ST2细胞的生长有抑制作用，差异有统计学意义（P<0.05），其他各组含药血清对ST2细胞抑制率与空白组血清比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。
 

图2  不同比例蛇床子和补骨脂含药血清对ST2细胞的抑制率
Figure 2  Inhibition rates of ST-2 cells by sera containing different proportions of Fructus Cnidii and Psoralea corylifolia
Data were represented as x±s, n=3. *P<0.05, vs control group.

2.3  不同比例蛇床子和补骨脂的含药血清对MDA-MB-231BO细胞迁徙能力的影响  与空白血清比较，各比例蛇床子和补骨脂的含药血清均有抑制MDA-MB-231BO细胞体外运动能力的作用，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见图3。

图3  不同比例蛇床子和补骨脂含药血清对MDA-MB-231BO迁徙能力的影响
Figure 3Effects of sera containing different proportions of Fructus Cnidii and Psoralea corylifolia on migration of MDA-MB-231BO cells

Data were represented as x±s, n=3. *P<0.05, **P<0.01, vs control group.

2.4  不同比例蛇床子和补骨脂的含药血清对ST2细胞ALP活性的影响  与空白组比较，蛇床子和补骨脂4︰0配伍组ST2细胞的ALP活性下降，差异有统计学意义（P<0.05）；蛇床子和补骨脂3︰1、1︰1、1︰3、0︰4配伍组ST2细胞的ALP活性略有增高，其中蛇床子和补骨脂1︰1配伍组差异有统计学意义（P<0.05）。见图4。

图4  不同比例蛇床子和补骨脂含药血清对ST2细胞ALP活性的影响
Figure 4  Effects of sera containing different proportions of Fructus Cnidii and Psoralea corylifolia on ALP activity of ST-2 cells
Data were represented as x±s, n=3. *P<0.05, vs control group.

2.5  不同比例蛇床子和补骨脂的含药血清对ST2细胞矿化结节形成的影响  与空白组比较，蛇床子和补骨脂3︰1、1︰1和0︰4配伍组矿化结节的数目增加，差异有统计学意义（P<0.05， P<0.01）。蛇床子和补骨脂4︰0和1︰3配伍组矿化结节数虽有增加，但与空白组比较差异无统计学意义。所有实验组ST2细胞均形成矿化结节。见图5和图6。

图5  不同比例蛇床子和补骨脂含药血清对ST2矿化结节形成的影响
Figure 5  Effects of sera containing different proportions of Fructus Cnidii and Psoralea corylifolia on mineralized nodule formation of ST-2 cells

Data were represented as x±s, n=3. *P<0.05, **P<0.01, vs control group.

图6  不同比例蛇床子和补骨脂含药血清对ST2矿化结节形成的影响（倒置生物显微镜，×200）
Figure 6  Effects of sera containing different proportions of Fructus Cnidii and Psoralea corylifolia on mineralized nodule formation of ST-2 cells (Inverted biological microscopy, alizarin red staining, ×200)
A: Control group; B: 4︰0 group; C: 3︰1 group; D: 1︰1 group; E: 1︰3 group; F: 0︰4 group.

3  讨论
     骨髓微环境中的间充质干细胞与乳腺癌细胞的交互作用是乳腺癌细胞向骨髓早期转移的重要途径^［16］。骨髓微环境中的间充质干细胞是存在于骨髓微环境中的具有多向分化潜能的成体干细胞，它在合适的诱导条件下可向成骨细胞、造血基质细胞和肌纤维母细胞等方向分化^［17,18］。骨髓微环境中的间充质干细胞与肿瘤的发生、发展密切相关，一方面参与肿瘤微环境的改造，增加肿瘤细胞的运动、浸润和转移能力；另一方面肿瘤细胞诱导骨髓微环境中的间充质干细胞转化为肌纤维母细胞，为肿瘤组织提供营养支持和生长的土壤。根据以上资料我们对骨髓微环境和乳腺癌细胞分别进行研究，以探讨温肾药对对乳腺癌和骨微环境的影响。
     我们通过对不同比例的蛇床子和补骨脂共煎液的研究发现，蛇床子和补骨脂配伍比例1︰1组不仅能够抑制乳腺癌细胞增殖和迁移，还能增加ST2细胞活性。其抑癌、坚骨作用机制目前尚不清楚，下一步我们将建立乳腺癌细胞、骨髓基质细胞的共培养体系，从基因、蛋白水平深入研究温肾药对骨髓微环境和乳腺癌细胞之间交互作用的影响及蛇床子和补骨脂最佳配伍比例的有效物质基础。