Received February 27, 2011; accepted March 8, 2011; published online June 15, 2011.
Full-text LinkOut at PubMed. Journal title in PubMed: Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao.
    
Correspondence: Guang-wei Zhong; Tel: 0731-84327213; E-mail: zgw7512@sina.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No. 30500644); 湖南省中医药科研计划项目(No. 2009047)

     原发性高血压(essential hypertension, EH)是一种常见的心血管系统疾病，具有患病率高和并发症多的特点。随着我国经济的发展和人民生活水平的提高，高血压的患病率较10年前明显增加，是中国人群心脑血管病发病和死亡最重要的危险因素^［1］。平肝潜阳法是治疗高血压的传统治法之一，不仅能有效降低患者的血压，还能改善患者的生命质量，降低并发症的发生^［2］。为了进一步揭示高血压的发生机制及平肝潜阳方药的作用机制，本研究从蛋白质组学水平研究平肝潜阳方药对自发性高血压大鼠血管组织蛋白质表达的影响。

1  材料与方法
1.1  实验材料
1.1.1  实验动物  正常健康雄性Wistar京都(Wistar-Kyoto，WKY)大鼠10只，清洁级，10周龄，体质量(200±10)g，由中南大学湘雅医学院实验动物部提供(许可证号：医动字第20-010号)；自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)20只，雄性，清洁级，10周龄，体质量(200±10)g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK(沪)2003-0003。饲养环境温度(21±2)℃，人工照明12 h/d，自由饮水，适应性喂养1周后进行实验。

1.1.2  药品与试剂  平肝潜阳方由天麻10 g、钩藤20 g、石决明30 g、煅牡蛎30 g、牛膝10 g组成(药材由中南大学湘雅医院药剂科中药房提供)，经鉴定均符合中国药典2005年版质量要求。石决明先煎20 min，钩藤后下，30 min煎煮两次后再将药液合并过滤，醇沉，回收溶剂至浸膏状，生药含量为4.0 g/mL。
     2D蛋白质定量试剂盒和固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）干胶条(pH 3~10, 24 cm)均由美国Amersham Biosciences公司提供，考马斯亮蓝由美国Sigma公司提供。

1.1.3  主要仪器  BP-420四通用道生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)，旋转平台（根据文献自制^［3］），Ettan DALT Ⅱ System垂直电泳槽(美国Amersham公司)，PDQuest 7.0分析软件(美国Bio-Rad公司)，ImageScanner扫描仪(美国Amersham公司)，EXL800自动酶标仪(美国Bil-Tek Instrument公司)，Voyager-DE STR 4307基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱仪(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS) (美国Applied Biosystem公司)。Mascot肽质量指纹图数据库查询软件为美国Matrix Science公司产品。
1.2  实验方法
1.2.1  动物分组及给药  WKY大鼠10只为正常组。20只SHR适应性喂养1周后，血压高于22.7 kPa者按数字表法随机分为2组，即模型组(灌服饮用水)和治疗组（灌服平肝潜阳方浸膏，给药量为10 mL/kg），至实验结束无动物脱落。每周称量体质量1次，并且根据体质量调整给药量，给药时间为4周。

1.2.2  血压和心率的测定  大鼠末次给药后2 h，采用自制的无创伤性间接测压仪（中南大学湘雅医学院心脏生理研究室）测定清醒状态下大鼠的心率和尾动脉血压^［4］。正式测量前每天测压训练1次，共5 d，待大鼠适应环境、血压稳定后，开始实验观察。测压前将大鼠放入(37±1)℃电热恒温箱内预热15 min后，再测定大鼠尾动脉收缩压及心率。给药期间每周测1次，测量时间为给药后2 h，重复测量3次。
1.2.3  易激惹程度观察及评分  易激惹程度评分参照文献方法^［5］。1分：捉持颈部时尖叫、惊跳；2分：捉持颈部时激怒欲咬人；3分：提尾部时即尖叫、惊跳，甚至欲咬人或与同笼大鼠频繁打斗，频咬铁笼；上述情况不明显者为0分。每周评价1次。

1.2.4  旋转耐受时间测量  将大鼠置于自制旋转平台上，转速45 r/min，如果转动2 min后仍不跌下，则停止实验；如果在2 min内跌下，则计算其在旋转平台上持续的时间。每周评价1次。
1.2.5  组织标本的处理  所有大鼠在处死前均腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉。剪开腹腔，剪取胸主动脉壁组织，用4 ℃生理盐水清洗后，放入液氮中冷冻，后转移至－80 ℃低温冰箱备用。
1.2.6  血管组织蛋白表达检测
1.2.6.1  大鼠血管组织总蛋白的提取  将标本从－80 ℃低温冰箱中取出，置于研磨管中，加入组织裂解液200 μL（7 mol/L尿素，2 mol/L硫尿素，10 mmol/L二硫苏糖醇，4% 3-［3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基］丙磺酸盐，1 mmol/L乙二胺四乙酸，40 mmol/L三羟甲基氨基甲烷，1 mmol/L苯甲基磺酰氟,40 mmol/L Tris-base），放入液氮中冷冻成硬块，然后转移到冰台上，在研磨管中反复研磨，4 ℃静置1 h后，12 000×g离心60 min，取5 μL上清用2D蛋白质定量试剂盒进行蛋白定量，按试剂盒说明书的方法测定蛋白浓度。余上清冻存于－80 ℃备用。

1.2.6.2  双向电泳及考马斯亮蓝染色  (1)用24 cm干胶条（pH 3~10），上样量为800 μg，具体操作按IPG等电聚焦（美国Amersham公司）指南的方法进行。20 ℃水化12 h，行等电点聚焦，总电压时间积达64 000 V·h。(2)聚焦后将胶条先后在含二硫苏糖醇和吲哚乙酸的平衡液中平衡15 min，然后行12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色。
1.2.6.3  凝胶图谱分析  凝胶通过ImageScanner扫描仪及LabScan扫描软件进行扫描，获取图像；利用PDQuest 7.0分析软件对图像进行强度校正、点检测、背景消减、匹配等分析。
1.2.6.4  质谱样本准备、质谱分析和数据库查询  选取表达有显著差异的16个蛋白质点，参照李茂玉等^［6］描述的方法进行。
1.2.6.5  数据库查询  采用Matrix Science公司的Mascot软件搜索数据库。肽质量控制在800～4 000，肽片段质量最大误差控制在0.05%，酶解片段不完全选择为1个，物种来源为大鼠，离子选择［M+H］＋和单同位素峰（monoisotopic），半胱氨酸经碘乙酰胺(carbamidomethyl)处理，信号峰采用Mascot Distiller软件识别。

1.3  统计学方法  采用SPSS 11.0软件对实验数据进行统计学分析，计量资料数据以x±s表示，多组均数的比较用单因素方差分析，组间比较采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果
2.1  平肝潜阳方药对SHR血压和心率的影响  治疗前，SHR的血压、心率与正常大鼠相比较均明显升高(P<0.05)。与模型组比较，治疗组第1周后的收缩压即降低，心率明显减慢(P<0.05)，并随疗程延长逐渐下降。见表1和2。

表1  各组大鼠不同时间的收缩压
Table 1  Systolic blood pressure of rats in different groups at different time points

^*P<0.05, ^**P<0.01, vs model group.
   
表2  各组大鼠不同时间的心率
Table 2  Heart rate of rats in different groups at different time points

^*P<0.05, ^**P<0.01, vs model group.

2.2  平肝潜阳方药对SHR易激惹程度和旋转耐受时间的影响  治疗4周后，与正常组比较，模型组SHR易激惹程度评分升高，旋转耐受时间缩短(P<0.01)。与模型组比较，治疗组易激惹程度评分降低(P<0.05)，旋转耐受时间延长(P<0.05)。见表3。

表3  各组大鼠易激惹程度和旋转耐受时间
Table 3  Irritability degree and rotation endurance time of rats in different groups

2.3  血管组织双向凝胶电泳图谱及差异蛋白质点分析  采用ImageScanner扫描仪扫描获取图像，然后通过ImageMaster 2D Elite 4.01（美国Amersham Biosciences公司）分析软件对其进行点检测。对3组大鼠血管组织的总蛋白质进行了3次重复性检测，获得了重复性较好的双向凝胶电泳图谱(见图1)，其蛋白质点数依次为(619±52)、(641±48)和(625±58)个。分别将其中的一块胶定为参考胶进行3块凝胶间的蛋白质点的匹配，平均匹配点数为(538±56)个，其匹配率为85.6%。经图像分析统计后发现，与正常组比较，模型组蛋白质点表达上升2倍及以上的有12个，下降2倍及以上的点有15个。模型组表达下调的15个蛋白质中治疗组有10个表达增强，而表达上调的12个蛋白质中治疗组有8个表达降低。

图1  各组大鼠血管组织双向凝胶电泳图谱
Figure 1  Two-dimensional electrophoresis map of proteins from vascular tissue of rats in three groups

C: Normal group; M: Model group; Z: Treatment group. SDS-PAGE: sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; PI: isoelectric point.

2.4  差异表达蛋白质点的MALDI-TOF MS鉴定及数据库查询  选取图像分析统计后的差异大于2倍的蛋白质点，胶内酶切提取蛋白进行质谱鉴定。共得到16个肽质量指纹图谱，其中3个无质谱结果，搜索到13个有意义的蛋白质。排序为11号的蛋白质点（线粒体融合蛋白2）的肽质量指纹图见图2，经Mascot软件搜索到的7号蛋白质点的评分见图3。初步鉴定的蛋白质按功能进行初步分类，主要有代谢酶类、信号转导蛋白、抗氧化蛋白和细胞骨架蛋白等。其中鉴定的蛋白分别为凝血酶敏感蛋白1、腺苷酸环化酶联合蛋白1、γ肌动蛋白、钙结合蛋白A9、肌球蛋白调节轻链、抗增殖蛋白、Ras抑制蛋白、热休克蛋白27（heat shock protein-27，HSP-27）、膜联蛋白A1、线粒体融合蛋白2（mitofusin-2，MFN-2）、Rho-GDP相关抑制因子2、硫氧还蛋白依赖过氧化物酶和电位依赖性阴离子选择性通道1。见表4。
     
     

图2  MALDI-TOF MS检测的线粒体融合蛋白2差异表达蛋白质点肽指纹图谱
Figure 2  Peptide mass fingerprinting of mitofusin-2 by MALDI-TOF MS analysis

MALDI-TOF MS: matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.
    

图3  线粒体融合蛋白2差异点肽质量指纹图谱在Swissport数据库中的Mascot检索结果

Figure 3  Mascot search results of peptide mass fingerprinting of mitofusin-2 in Swissport

表4  Mascot软件在数据库中收索到的有意义的蛋白
Table 4  Proteins identified by Mascot software

Mw: molecular weight; PI: isoelectric point.

3  讨论
     高血压为常见、多发的心脑血管疾病，是冠心病及脑卒中的重要危险因素。据统计，我国15岁以上人群高血压的患者率为18.8%，患者已超过2亿^［7］。SHR与人类的高血压发病相似，是目前国际公认最接近于人类原发性高血压的动物模型，是研究高血压病发病机制和筛选降压药物较为理想的动物模型^［8］。本实验选用WKY大鼠和SHR，因为两组的遗传背景相同，且10周龄SHR血压稳定在170 mmHg左右，出现紧张、打斗，易激惹程度显著增加，耐受转台旋转时间减少等改变，与人类高血压类似。
     高血压属于中医学“眩晕”、“头痛”等病证范畴，经临床流行病学调查及文献资料检索，认为肝阳上亢证是高血压病各期(特别是Ⅰ和Ⅱ级)及不同病程(早、中期)中构成比最高的证候^［9］。专家认为美国高血压预防、监测、评估和治疗委员会第7次报告公布的高血压治疗指南（JNC-7）提出的“高血压前期”多已有“肝阳偏亢”证候的表现^［10］。故我们认为早、中期高血压病位主要在肝，治疗应注重从肝论治，重在平肝潜阳，方药选择平肝潜阳方（由天麻钩藤饮化裁而成）。前期研究结果显示，平肝潜阳方对早、中期高血压病患者有良好的临床疗效，不仅降低血压，而且能够改善临床症状，提高生命质量，调节血脂水平^［2］。本实验发现平肝潜阳方药能够有效地降低血压和减慢心率，改善SHR的易激惹程度和旋转耐受时间，说明中药复方能够改善大鼠的行为学指标。
     近年来许多学者已从整体、器官、细胞、分子等层次对高血压的发生机制及其中医药治疗的疗效机制进行研究，但从蛋白质水平探讨中药复方治疗高血压的研究较少有报道。在本实验中，我们应用差异蛋白质组技术，建立SHR的血管组织蛋白质表达谱，发现平肝潜阳方药治疗前后血管组织的蛋白质表达谱存在差异表达，其中10个表达上调，8个下调。通过对差异蛋白质点进行原位酶解及质谱鉴定，鉴定了其中的13个蛋白质，这些蛋白多数为代谢酶类、信号转导蛋白、抗氧化蛋白和细胞骨架蛋白。
     HSP-27是在人细胞中发现的一种相对分子质量为27 ku的HSP。HSP-27保护细胞免受各种应激因素的损伤，参与细胞的增殖、分化及细胞凋亡的信号转导，调节氧化应激。Terrier等^［11］发现，在肺动脉高压患者血清蛋白质双向电泳图谱中，HSP-27含量明显升高，推测其可能与高血压的发生有关。我们的前期研究表明，HSP-27参与SHR血管平滑肌细胞的增殖^［12］。本研究结果显示，HSP-27在SHR主动脉血管组织中的表达增多，经平肝潜阳法治疗后表达量下降，它可能在高血压病的发生及平肝潜阳法治疗过程中具有重要作用。
     膜联蛋白A1是结构相关钙依赖的磷脂结合蛋白超家族成员之一，其功能涉及细胞生命活动的各个方面，包括细胞分泌、信号转导、炎症反应和细胞凋亡等。Touyz等^［13］发现WKY大鼠血管平滑肌膜联蛋白A1结构染色体畸变是SHR的1.5~2倍。有研究认为膜联蛋白A1可能参与冠心病的发生发展^［14］。在本研究中，模型组大鼠膜联蛋白A1高表达，经平肝潜阳方药干预后膜联蛋白A1表达降低，可能与膜联蛋白A1参与血管平滑肌细胞的凋亡和增殖有关。
     MFN-2是促进线粒体融合的蛋白之一，由757个氨基酸组成，由细胞核基因编码，定位于线粒体的外膜上。迄今已经发现该基因具有促进线粒体融合的功能，还有细胞增殖抑制功能和细胞凋亡保护功能^［15］。本研究表明，MFN-2基因在正常大鼠血管组织中高表达，而在SHR中低表达，与Chen等^［16］的研究一致，经中药复方干预后表达增强。有研究显示该基因产物可以抑制RAS-raf-ERK-MAPK途径，从而有效地阻遏细胞周期和抑制细胞增殖^［17］。
     Rho为小G蛋白家族的一员，以活性型和非活性型2种形式存在。活性型Rho-GTP与效应蛋白结合调节一系列的生物学过程^［18］，参与细胞的生长、分化、癌变、浸润和转移每一个步骤。GDI为其调节因子之一，与Rho-GDP结合，存在于胞浆中，抑制Rho-GDP转换成Rho-GTP。在本研究中，模型组GDI表达下调，对Rho的抑制减弱，Rho的激活抑制了神经元的生长，与以往研究报道的高血压患者神经传导减弱，功能障碍相符^［19］。一系列的证据表明Rho的调节基因，如GDI对于细胞的生物学行为发挥更大的作用。
     总之，我们通过蛋白质组学分析，发现了一些平肝潜阳方药治疗SHR后血管组织差异表达的蛋白质，但要确认这些蛋白质是否为中药复方治疗高血压相关的蛋白质，还需深入研究其结构、功能及在高血压发生发展中所起的作用。

4  利益冲突
     本文作者声明不存在任何与本稿件相关的利益冲突。