Taxa de mortalidade em ratos submetidos à isquemia e reperfusão hepática, tratados ou não com alopurinol¹

 

Ernani Luís Rhoden²
Marcelo Mauri³
Cláudia Ramos Rhoden⁴
Márcio Luís Migliavacca Leal⁵
Marcelo Sabedotti⁵
Márcio Luís Lucas⁵
Luiz Pereira-Lima⁶

 

 

Rhoden EL, Mauri M, Rhoden CR, Leal MLM, Sabedotti M, Lucas ML, Pereira-Lima L. Taxa de mortalidade em ratos submetidos à isquemia e reperfusão hepática, tratados ou não com alopurinol. Acta Cir Bras [serial online] 1999 Oct-Dec;14(4). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb.

RESUMO: A isquemia transitória hepática tem sido cada vez mais amplamente utilizada. Contudo, essa atitude, embora muitas vezes benéfica, é contrabalançada pelos efeitos adversos advindos da isquemia hepática e da congestão esplênica, assim como, das conseqüências da reperfusão. O objetivo dos autores é determinar os efeitos da isquemia seletiva em animais pré-tratados ou não com alopurinol, inibidor da xantina oxidase sobre a mortalidade dos animais. Foram utilizados 30 ratos assim divididos: Grupo I (n=10): pré-tratados com alopurinol e submetidos à laparotomia e exposição do pedículo hepático por 45 minutos. Grupo II (n=10): tratados com alopurinol e submetidos à isquemia hepática seletiva por 45 minutos. Grupo III (n=10): submetidos apenas à isquemia por 45 minutos. A mortalidade pós-operatória foi avaliada a cada 24 horas, por um período de 10 dias. Entre os animais do grupo I, não foram observados óbitos, entretanto, naqueles dos grupos II e III, as mortalidades globais foram respectivamente 20 e 46,7%. Diferença estatisticamente significativa, apenas, entre a mortalidade observada no grupo III em relação ao controle (p<0,05). A mortalidade pós-operatória no grupo de animais submetidos à isquemia sem pré-tratamento com alopurinol ascende as cifras de 46,67% dos animais, enquanto naqueles pré-tratados com alopurinol houve um importante decréscimo para 20%. Embora sem uma distinção estatisticamente significativa, reflete uma tendência de um efeito protetor do alopurinol na isquemia e reperfusão hepática.
DESCRITORES: Reperfusão. Alopurinol. Espécies de oxigênio reativas.

 

 

INTRODUÇÃO

A isquemia transitória hepática, muitas vezes requerida em procedimentos cirúrgicos sobre o fígado, seja para limitar as perdas sangüíneas ou quando a mesma se torna obrigatória, como é o caso dos transplantes, tem sido cada vez mais utilizada (1,2,3). Contudo, essa atitude, muitas vezes benéfica, é contrabalançada pelos efeitos adversos advindos da isquemia hepática e da congestão esplâncnica, assim como das conseqüências da reperfusão, significativamente deletéria, com sérias repercussões funcionais sobre o órgão (4,5,6).

O fenômeno isquêmico e reperfusional é, certamente, multifatorial e o envolvimento das espécies ativas do oxigênio (EAO) derivados do metabolismo anormal do oxigênio é um dos prováveis fatores determinantes da patogênese da injúria decorrente deste (7,8,9,10,11,12). Estudos distintos respaldam o mecanismo das EAO evidenciando efeitos benéficos de anti-oxidantes e, por outro lado, exacerbação do dano na deficiência destes, assim como o fato da lipoperoxidação ser evento bem caracterizado neste fenômeno oxidativo.

No que se refere à ação geradora de EAO pela enzima xantina oxidase, os resultados de diversos estudos experimentais têm sido controversos: trabalhos mostram efeitos benéficos de substâncias inibidoras da xantina oxidase sobre a função hepática e lipoperoxidação enquanto outros não demonstram efeitos significativos (13,14,15).

O alopurinol e seu metabólito principal, a aloxantina, são inibidores competitivos e não-competitivos, respectivamente, da enzima xantina oxidase, sendo esta inibição seu principal efeito farmacológico (13,14,17,18). A aloxantina possui uma permanência longa nos tecidos e é, indubitavelmente, responsável pela maior parte da atividade farmacológica da droga (14,19).

A principal ação proposta para os efeitos benéficos do alopurinol seria a de que inibindo a enzima xantina oxidase, que catalisa de modo irreversível a transformação da hipoxantina, proveniente do catabolismo de compostos energéticos de purina tais como o ATP, ADP, AMP, em xantina. Portanto, interrompendo essa rota de degradação, permitiria-se a ressíntese do ATP durante a fase de revascularização, restabelecendo assim, pelo menos em parte, o nível energético para a manutenção dos eventos metabólitos que se processam em nível celular e subcelular (20,21,22,23). Entretanto, os efeitos mais pronunciados residiriam, principalmente, na sua capacidade de inibir a geração de EAO no período reperfusional, tendo em vista ser a enzima xantina oxidase aceptora de elétrons e, portanto, capaz de formar o radical superóxido, hidroxil e peróxido de hidrogênio (EAO) (14,16,22,24).

O objetivo dos autores é determinar os efeitos da isquemia transitória hepática normotérmica em ratos pré-tratados e não com alopurinol sobre a mortalidade destes animais.

 

MÉTODO

Animais

Para este estudo experimental randomizado foram utilizados 30 ratos Wistar machos, adultos, pesando entre 250 e 350 gramas, criados no Biotério da Disciplina de Farmacologia e Toxicologia da Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre (FFFCMPA). Os animais foram mantidos em número de seis em gaiolas plásticas com dimensões de 47 X 34 X 18 cm, em sala com temperatura controlada de 22A 2 ^oC e, ciclo claro de luz das 7 às 19 h, recebendo ração padronizada (Purina, Nutripal, Porto Alegre, RS, Brasil) e água "ad libitum".

Fármacos

#suspensão de alopurinol (Zyloric®, Glaxo Wellcome, 25mg/ml), preparada em solução fisiológica.

#solução anestésica composta (1:1) de cloridrato de xilazina (Kensol®,Körnig, Argentina, 20 mg/ml) : cloridrato de quetamina (Vetanorcol®, Körnig, Argentina, 50 mg/ml).

Procedimento experimental

Os animais foram divididos em três grupos de 10 animais cada:

#GRUPO I (CONTROLE): Neste grupo os animais receberam 50 mg/Kg de alopurinol, administrado por via intraperitonial (i.p.) 5 e 1 hora antes da cirurgia. Após a anestesia com a referida solução na dose de 1 mg/kg, via i.p. e posterior laparotomia mediana com aproximadamente 4 cm de extensão, os animais permaneceram com o ventre aberto por um período de 45 minutos, ao final do qual efetuou-se o fechamento da cavidade abdominal com fio monofilamentar 3.0 (Mononylon, Ethicon) de forma contínua e em plano único. Além disso, os animais receberam 2 ml de soro fisiológico, para rehidratação, por via i.p., no final do procedimento.

#GRUPO II (ISQUEMIA E ALOPURINOL): Neste grupo de animais, além dos procedimentos descritos anteriormente (grupo I), efetuou-se a interrupção sangüínea seletiva dos lobos hepáticos médio e esquerdo por um período de tempo total de 45 minutos. Ao final deste intervalo de tempo, a pinça foi removida e a cavidade abdominal fechada, como já descrito. Além disso, foram administrados 2ml de soro por via i.p. para rehidratação.

#GRUPO III (ISQUEMIA): Nestes animais foram efetuados os mesmos procedimentos descritos anteriormente no Grupo II, porém não receberam a suspensão de alopurinol.

Todos os animais foram acondicionados em gaiolas e observados durante um período de 10 dias, sendo a mortalidade pós-operatória avaliada a cada 24 horas. A variabilidade da mortalidade entre os grupos foi analisada pelo Teste Qui-Quadrado, considerando um alfa = 5%.

 

RESULTADOS

Entre os animais do Grupo I (Controle) não foram observados óbitos, entretanto, naqueles dos Grupos II e III as mortalidades globais foram respectivamente 20 e 46,7%, respectivamente. Diferença estatisticamente significativa, apenas, entre a mortalidade observada no Grupo III em relação ao controle (p<0,05). A maioria dos óbitos ocorreram nas primeiras 24 horas após o procedimento : 13,3 e 40% entre os grupos 2 e 3, respectivamente (p>0,05) (Tabela 1).

 

 

DISCUSSÃO

A reperfusão sangüínea que se segue ao período isquêmico tem recebido cada vez mais atenção como fator potencial de dano ao órgão, pela possibilidade de gerar a formação de EAO, elementos radicais extremamente reativos com capacidade oxidativa e destrutiva das membranas fosfolipídicas celulares. Na realidade, tem sido proposto que o período reperfusional é tão ou mais deletério ao(s) órgão(s) submetido(s) a isquemia, do que esta propriamente (6).

Nas situações de isquemia e reperfusão, um dos mecanismo mais destacado como responsável pela geração de EAO tem sido relacionado à enzima xantina oxidase (8,12,21,24,25,26,27,28,29), e sobre a qual dirigimos a atenção no presente estudo.

O alopurinol, droga estudada no presente estudo, além da propriedade de inibir a enzima xantina oxidase, enzima considerada fundamental na geração do radical superóxido, apresenta a propriedade de agir como "scavenger" de EAO, assim como, a de permitir a ressíntese do ATP pela maior preservação da hipoxantina (22).

Na isquemia hepática completa em animais (ratos e cães) de laboratório, o tempo máximo tolerável é de 30 minutos, conforme demonstrado no estudo de Mackenzie (30), onde cães submetidos a uma interrupção completa do fluxo aferente sem derivação portal por períodos maiores de tempo levava a uma mortalidade universal dos animais decorrente do efeito lesivo da isquemia sobre o fígado e da congestão esplâncnica. Entretanto, a disposição anatômica do fígado de ratos em 5 lobos com pedículos individuais permite uma isquemia seletiva, removendo, assim, o fator congestão esplâncnica como elemento causador de óbitos.

A isquemia hepática leva a uma mobilização das reservas energéticas sob forma de trifosfato de adenosina (ATP) da unidade celular e eventos celulares que necessitam da ação ativa de determinadas bombas de íons, que sofrem alterações causando uma variação da homeostase celular. Entre estas, observa-se o acúmulo desordenado de cálcio intracelular, o que leva à ativação de várias enzimas líticas e também a transformação da xantina dehidrogenase em sua forma ativa, a xantina oxidase. Esta última é capaz, no período reperfusional, de transformar de forma irreversível a hipoxantina em xantina, e além disso, como a referida enzima possui capacidade de ser aceptora de elétrons, transforma o oxigênio molecular (advindo da reperfusão) em radical superóxido, e, também, em outros radicais decorrentes (peróxido de hidrogênio e radical hidroxil), com potencial efeito lesivo hepatocitário. A lipoperoxidação, evento decorrente da ação das espécies radicais, leva a uma desestruturação celular e conseqüente morte celular adicional a aquela produzida pela isquemia.

O pré-tratamento de animais com alopurinol, substância inibidora da enzima xantina oxidase, poderia interferir na geração das espécies radicais e consequentemente reduzir a peroxidação dos componentes lipídicos das membranas celulares, reduzindo o dano decorrente da reperfusão de órgãos previamente isquêmicos.

O reflexo desses fenômenos sobre a mortalidade dos animais observados no presente estudo ocorreram predominantemente nas primeiras 48 horas após o procedimento, provavelmente decorrente de uma ação aguda decorrente do dano induzido sobre o fígado.

Embora não se tenha observado uma distinção estatisticamente significativa entre os animais pré-tratados, e não, com alopurinol, as taxas de mortalidade globais de 20 e 46,7%, respectivamente, indicam pelo menos uma tendência para uma maior ocorrência do evento naqueles ratos não submetidos ao pré-tratamento com a referida substância. Ou seja, uma tendência de efeito protetor do alopurinol sobre o dano decorrente da isquemia normotérmica transitória hepática.

 

CONCLUSÃO

A enzima xantina oxidase parece exercer uma significativa atividade no tecido hepático e a inibição de sua ação em situações de isquemia transitórias do fígado pode se traduzir por significativos efeitos benéficos.

 

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Rhoden EL, Mauri M, Rhoden CR, Leal MLM, Sabedotti M, Lucas ML, Pereira-Lima L. Mortality rates in rats submitted to hepatic ischemia-reperfusion, treated or not with allopurinol. Acta Cir Bras [serial online] 1999 Oct-Dec;14(4). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb.

SUMMARY: The transitory hepatic ischemia has been frequently used. However, this procedure, benefic some times, is contrabalanced by the adverse effects from the hepatic ischemia and esplenic congestion, as well as of the reperfusion consequences. The objective of the authors is to determine the effects of the selective ischemia in pretreated and not pretreated rats with allopurinol, inhibitor of the xantine oxidase enzyme, in the mortality of the rats. Thirthy Wistar rats were used and divided into three groups: Group I (n=10): pretreated with allopurinol and submitted to laparotomy and exposition of the hepatic vessels for 45 min. Group II (n=10): pretreated with allopurinol and submitted to selective hepatic ischemia for 45 minutes. Group III (n=10): Submitted only to selective hepatic ischemia for 45 min. The postoperative mortality was evaluated each 24 hours, by one period of 10 days. Among the animals of the group 1, it wasn't observed deaths, however, in those of the groups II and III, the global rates of mortality were, respectively, 20 and 46.67%. Statistically significative difference , was bettwen the observed mortality in groups I and III (p<0.05). The postoperative mortality in the group of animals submitted to ischemia without pretreatment with allopurinol was 46.67%, while in those animals pretreated with allopurinol, there was an important decrease to 20%. Even without an statistically significative distinction, it reflects a tendency of a protector effect of the allopurinol in the hepatic ischemia and reperfusion.
SUBJECT HEADINGS: Reperfusion. Allopurinol. Reactive oxygen species.

 

 

 

Endereço para correspondência:
Ernani Luís Rhoden
Av. Alberto Bins, 456/73
90030-140 Porto Alegre-RS

Data do recebimento: 30/04/99
Data da revisão: 01/06/99
Data da aprovação: 03/07/99

 

 

 

¹. Trabalho realizado nos Departamentos de Farmacologia e Cirurgia da Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre (FFFCMPA).
². Urologista/Cirurgião Geral. Mestre em Clínica Cirúrgica pela FFFCMPA.
³. Aluno do Curso de Pós-Graduação em Clínica Médica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).
⁴. Professora Adjunta da Disciplina de Farmacologia e Toxicologia da FFFCMPA.
⁵. Monitores da Disciplina de Farmacologia e Toxicologia da FFFCMPA.
⁶. Professor Titular da Disciplina de Cirurgia Geral da FFFCMPA.