Bioquímica

 

Análise bioquímica das metaloproteases da matriz extracelular durante atrofia experimental das glândulas salivares submandibulares em ratos

 

Analysis of the matrix metalloproteases in duct-ligated submandibular salivary glands of rats

 

Ana Paula de SOUZA*
Paula Cristina TREVILATTO*
Alexandre Augusto ZAIA**
Sérgio Roberto Peres LINE***

 

 

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SOUZA, A. P.; TREVILATTO, P. C.; ZAIA, A. A.; LINE, S. R. P. Análise bioquímica das metaloproteases da matriz extracelular durante atrofia experimental das glândulas salivares submandibulares em ratos. Rev Odontol Univ São Paulo, v. 13, n. 2, p. 135-139, abr./jun. 1999.

O presente estudo teve por objetivo analisar a expressão das metaloproteases da matriz extracelular durante a atrofia experimental das glândulas submandibulares em ratos, causada pela obstrução do ducto excretor principal. Os zimogramas realizados com extratos das porções internas e externas das glândulas salivares normais e ligadas mostraram que as principais enzimas gelatinolíticas possuíam pesos moleculares variando entre 72 kDa e 65 kDa. A atividade dessas enzimas aumentou progressivamente até o período entre 5 e 10 dias após a ligação, decrescendo nos períodos subseqüentes. Foram também detectadas bandas migrando entre 92 kDa e 72 kDa, sendo essas enzimas detectadas em quantidades significativas apenas na região da cápsula da glândula, no período de 2 dias. A confirmação de que as enzimas detectadas eram metaloproteases foi feita pelo uso de inibidores específicos. Os resultados sugerem que as metaloproteases da matriz têm um papel importante na remodelação da matriz extracelular durante a atrofia experimental da glândula submandibular.

UNITERMOS: Metaloproteinases; Glândulas salivares; Atrofia.

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INTRODUÇÃO

A atrofia das glândulas salivares pode ocorrer por obstrução ductal causada por cálculo, infecção ou processos neoplásicos ou como conseqüência de doenças sistêmicas ou envelhecimento^12,15. Os efeitos da obstrução glandular têm sido extensivamente estudados em animais através da ligadura do ducto excretor principal das glândulas submandibulares^1,4,16.

A obstrução do ducto excretor das glândulas salivares causa redução da secreção salivar¹⁰ e atrofia progressiva das células acinares e ductais, com extensas alterações morfológicas e bioquímicas^{6,14,15,18,19,20}. A atrofia glandular causada pela obstrução experimental do ducto é um processo reversível, pois as células acinares e ductais recobram o aspecto histológico normal após a recanalização do ducto ligado²⁰.

As metaloproteases da matriz compreendem uma família de enzimas que apresentam especificidade pelas macromoléculas da matriz extracelular. A família das metaloproteases é formada por pelo menos nove membros que exibem similaridades estruturais e funcionais. Entre estas, encontra-se a classe das colagenases, enzimas secretadas por fibroblastos e neutrófilos que possuem a habilidade única de iniciar a clivagem da super-hélice do colágeno. As metaloproteases da matriz são secretadas na forma de zimógeno^5,17.

Essas enzimas desempenham papel importante na remodelação da matriz em vários processos fisiológicos e patológicos. Na involução pós-parto as MMPs participam da remodelação tecidual degradando a matriz sintetizada durante a gestação¹³. Em doenças como a periodontite, o acúmulo de neutrófilos no ligamento periodontal, devido à inflamação decorrente da presença da placa bacteriana, favorece a degradação tecidual e a reabsorção óssea, uma vez que essas células sintetizam MMPs que contribuem com o rápido breakdown do colágeno, levando a perdas rápidas de estruturas periodontais^2,8,21,22.

Apesar de as alterações que ocorrem no parênquima glandular já terem sido extensivamente estudadas, pouca atenção tem sido dada aos componentes da matriz extracelular durante a atrofia experimental da glândula submandibular²³. Nossos estudos mostraram que a atrofia glandular é acompanhada por um rápido aumento na deposição do colágeno nas regiões intralobulares e septais. Este trabalho também mostrou que a expressão das fibras elásticas não é significativamente alterada. O objetivo do presente trabalho é de analisar a expressão das metaloproteases da matriz durante a atrofia experimental de glândulas salivares de ratos, provocada pela obstrução de seu ducto excretor principal.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Atrofia glandular

Foram utilizados 12 ratos (Wistar), machos, adultos, pesando aproximadamente 200 g, provenientes do Biotério Central da UNICAMP. Os animais foram alimentados com ração e água ad libitum. Sob anestesia com injeção intraperitoneal de hidrato de cloral a 10% (0,4 ml para 100 g de peso do animal), foram realizadas tricotomia na região ventral do pescoço, anti-sepsia local e incisão sagital mediana de aproximadamente 4 cm de comprimento. As glândulas submandibulares foram identificadas e os ductos excretores principais direito e esquerdo foram dissecados com tesoura de ponta rômbica e isolados dos vasos sangüíneos que irrigam a glândula. Um fio de algodão foi passado ao redor do ducto e amarrado firmemente, tomando-se o cuidado de não incluir os vasos que nutrem a glândula na ligadura. Como controle foram utilizadas glândulas submandibulares normais não-ligadas de animais submetidos ao ato cirúrgico. A ferida cirúrgica foi suturada com pontos simples isolados. Os animais foram sacrificados por inalação excessiva de éter etílico nos períodos de 2, 5, 10, 20 e 30 dias após a ligadura. As glândulas foram retiradas, limpas e pesadas. As porções correspondentes a cápsulas e parênquima glandular foram separadas mecanicamente com auxílio de uma espátula e estocadas em nitrogênio líquido.

Extração de metaloproteases

As metaloproteases foram extraídas segundo o protocolo modificado de ROBINSON et al.¹¹(1992). Os tecidos foram homogeneizados em solução contendo 0,25% Triton X-100, 10 mM CaCl2, 2 mM PMSF e 2mM NEM a 4°C e centrifugados 20 minutos a 6.000 g. As metaloproteases foram extraídas com tampão 50 mM Tris-HCl pH 7,4 contendo 100 mM CaCl2, 2 mM PMSF e 2mM NEN por 30 minutos a 40°C. O extrato foi aliquotado e armazenado a -20°C.

Análise das metaloproteases

Zimograma

Quantidades iguais dos extratos (0,4 mg) foram incubadas com tampão de amostra (2% SDS; 125 mM Tris-HCl pH 6,8; 10% glicerol; 0,001% azul de bromofenol) e submetido a eletroforese em gel 10% de poliacrilamida⁹, contendo 1,6 mg/ml e 0,5 mg/ml de gelatina. Após eletroforese, o gel foi lavado duas vezes por 20 minutos em solução aquosa de 2% Triton X-100 e incubado em tampão 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM CaCl2 por 16 horas a 37°C⁷, A seguir, o gel foi corado com Coomassie blue (0,05%) por 4 horas e descorado em metanol 50% por 1 hora. As proteínas com atividades gelatinolíticas foram observadas como bandas negativas.

Ensaio de inativação das metaloproteases

As amostras dos extratos foram submetidas a eletroforese e lavadas nas mesmas condições do item anterior, incubadas por 16 horas a 37°C em tampão Tris-HCl/CaCl2, contendo um dos seguintes inibidores de proteases: 0,5 mM 1,10-fenantrolina (Sigma Chem. Co., St Louis, MO), 0,5 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, Reagen), 0,5 mM fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF, Sigma). Posteriormente, os géis foram corados com Coomassie blue (0,05%) por 4 horas e descorados em solução 50% metanol e 10% ácido acético.

 

RESULTADOS

Os zimogramas realizados com extratos das porções internas e externas das glândulas salivares normais e ligadas mostraram que as principais enzimas gelatinolíticas possuíam pesos moleculares variando entre 72 kDa e 65 kDa.

A análise das metaloproteases provenientes do parênquima glandular (porção interna) mostrou que a atividade das bandas de 72-65 kDa aumentava após a obstrução ductal atingindo um máximo entre 5 e 10 dias. No período de 30 dias, a atividade ainda estava acima dos níveis da glândula controle. Outras bandas com pesos moleculares inferiores a 40 kDa estavam presentes nos extratos das porções internas das glândulas. A atividade dessas enzimas diminuiu nas glândulas ligadas, sendo que após 5 dias apenas uma pequena atividade podia ser detectada (Figura 1).

 

 

A análise das metaloproteases provenientes da cápsula (porção externa) mostrou que a atividade das enzimas de 72-65 kDa aumentava progressivamente até o período de 5 dias, em relação à glândula controle, decrescendo até atingir níveis próximos aos normais em 30 dias. Foram também detectadas bandas migrando entre 92 kDa e 80 kDa, estando essas enzimas presentes em quantidades significativas apenas no período de 2 dias (Figura 2).

 

 

Os resultados das inibições feitas com extratos de glândulas submandibulares mostraram que a atividade proteolítica das bandas migrando entre 92 kDa e 65 kDa foi inibida pelo EDTA e fenantrolina, e não foram inibidas pelo PMSF. A atividade das enzimas migrando abaixo de 40 kDa não foi alterada por nenhum dos inibidores enzimáticos utilizados (Figura 3).

 

 

DISCUSSÃO

Tanto o padrão de expressão das enzimas quanto os pesos moleculares sugerem que as bandas de 72-65 kDa observadas nos ensaios gelatinolíticos correspondem à MMP-2³. As bandas observadas provavelmente correspondem ao zimógeno (72 kDa) e à enzima ativada (65 kDa). A MMP-2 é a metaloprotease mais abundante da matriz extracelular, sendo secretada por fibroblastos, queratinócitos, células endoteliais, macrófagos, osteoblastos e condrócitos, estando também presentes no plasma sangüíneo².

As variações observadas na atividade da MMP-2 durante a atrofia glandular podem ocorrer em conseqüência das alterações nas células do parênquima glandular. HASHIMOTO et al.⁶ (1992); TAKAI et al.¹⁸ (1985) mostraram que a obstrução do ducto da glândula submandibular em ratos e camundongos causa diminuição na expressão do fator de crescimento epidérmico e fator de crescimento nervoso. Deste modo é possível que os fatores subcutâneos secretados pelas células do parênquima glandular regulem a síntese e secreção de metaloproteases pelas células da matriz extracelular.

O padrão eletroforético das enzimas migrando entre 92-80 kDa sugere que estas bandas correspondem a MMP-9, que é produzida principalmente por leucócitos polimorfonucleares². Diferente da MMP-2, que é secretada logo após a síntese, a MMP-9 é armazenada em grânulos e secretada somente após estímulo. É provável que o aumento na atividade desta enzima observada no período de 2 dias na cápsula glandular seja devido à reação inflamatória resultante do trauma cirúrgico provocado durante a realização da ligadura do ducto.

Os ensaios de inibição mostraram que as enzimas com peso molecular entre 92 kDa e 65 kDa eram inibidas por quelantes de íons divalentes, o que é típico das metaloproteases. As enzimas com peso inferior a 40 kDa não foram afetadas por nenhum dos inibidores. São provavelmente enzimas salivares sintetizadas pelas células acinares do parênquima glandular. Isto explica a rápida diminuição na atividade dessas enzimas durante a atrofia glandular e serve como um controle interno da progressão da atrofia glandular.

Os resultados mostrados neste trabalho sugerem que as metaloproteases têm um papel importante na remodelação da matriz extracelular causada durante a atrofia da glândula submandibular em ratos. No entanto, a caracterização definitiva das metaloproteases detectadas no presente estudo só poderá ser feita através de análise de Western blot com a utilização de anticorpos específicos contra diversas metaloproteases da matriz.

 

CONCLUSÃO

Concluímos com este estudo que as metaloproteases participam do processo de remodelação da matriz extracelular durante o processo de atrofia ocorrido em glândulas submandibulares de ratos, apresentando um aumento na expressão dessas enzimas nos períodos iniciais e decaindo conforme a evolução da atrofia glandular.

 

 

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SOUZA, A. P.; TREVILATTO, P. C.; ZAIA, A. A.; LINE, S. R. P. Analysis of the matrix metalloproteases in duct-ligated submandibular salivary glands of rats. Rev Odontol Univ São Paulo, v. 13, n. 2, p. 135-139, abr./jun. 1999.

The purpose of the present study was to analyze the expression of the major metalloproteases in normal and ligated glands. The major metalloproteases detected had a molecular weight ranging from 72 to 65 kDa. The gelatinolytic activity increased progressively reaching a peak between 5 and 10 days after ligation. Bands with molecular weight ranging from 92-80 kDa were also detected in the capsule of the gland. The 92-80 kDa enzymes were only detected 2 days after ligation. The activity of these enzymes was supressed by specific inhibitors. Our results show that matrix metalloproteases play an active role in the extensive remodeling of the connective tissue that occurs during the atrophy of the submandibular gland.

UNITERMS: Metalloproteases; Salivary glands; Atrophy.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recebido para publicação em 04/01/98
Reformulado em 13/08/98
Aceito para publicação em 02/12/98

 

 

* Pós-graduandas, ** Professor Doutor em Endodontia e *** Professor Livre Docente em Histologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba - UNICAMP.