Identificación de mutaciones en el gen CFTR en pacientes chilenos con fibrosis quística Identification of cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) mutations in Chilean patients with cystic fibrosis Gabriela Repetto L, Helena Poggi M1, Paul Harris D, Héctor Navarro M, Ignacio Sánchez D, Ernesto Guiraldes C, M Angélica Pérez H, M Lina Boza R, Bessie Hunter M, M Elena Wevar C, Marisol Mediavilla R, Arnaldo Foradori C

Correspondencia a: Dra Gabriela Repetto L. Depto. Pediatría, Facultad de Medicina P. Universidad Católica de Chile. Marcoleta 367 Santiago, Chile. Fono: (56-2) 354 3753; Fax: (56-2) 638 4307; e-mail. grepetto@med.puc.cl

Background: Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease caused by mutations in the CFTR gene, that codes for a chloride channel located in the apical surface of epithelial cells. The main role of this protein is the regulation of chloride transport, and secondarily, of sodium and water to the extracellular space. More than 900 gene mutations have been described, and their relative frequency in different populations depends on their ethnic origin. Aim: To report the findings of Chilean patients with cystic fibrosis, in whom the presence of 20 common mutations was analyzed. Patients and methods: Fifty seven patients with established diagnosis or suspicion of CF were studied. The simultaneous identification of 20 mutations and the normal DF508 allele was done using polymerase chain reactions with a commercial assay. Results: Eight mutations were found. Fifty patients fulfilled diagnostic criteria proposed by the Consensus Panel of the CF Foundation and 66% of alleles were identified in this group. ∆F508 mutation was found in 45%. We did not identify mutations in any of the remaining 7 patients. Conclusions: Our results suggest that the majority of undetected mutations are associated with atypical phenotypes or that some patients in this series could have other diseases. We recommend to include mutation analysis in the evaluation of Chilean patients with CF. It is useful to establish prognosis and genetic counselling (Rev Méd Chile 2001; 129: 841-7).
(Key Words: Cystic fibrosis; Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator; Counseling; Genetics, medical)

Recibido el 16 de abril, 2001. Aceptado el 12 de junio, 2001.
Trabajo financiado por Child Health Foundation, Alabama, EEUU y
UDA Laboratorios Clínicos, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile.
Departamento de Pediatría y Laboratorio de Desarrollo y Biología Molecular, Facultad de Medicina,
Pontificia Universidad Católica de Chile; Servicios de Pediatría, Hospital Exequiel González Cortés,
Hospital San Borja-Arriarán y Hospital Base de Valdivia; y Unidades de Neumonología y Gastroenterología,
Hospital Luis Calvo Mackenna. Santiago de Chile.
¹ Bioquímica

La fibrosis quística es la enfermedad autosómica recesiva letal más frecuente en humanos. Clínicamente se caracteriza por la tríada de enfermedad pulmonar y sinusal crónica, insuficiencia pancreática exocrina y elevación de los niveles de sodio y cloro en sudor. Además, la mayoría de los hombres con esta enfermedad tiene infertilidad por ausencia congénita bilateral del vas deferens. La enfermedad se debe a una anomalía en el transporte de cloro a través del regulador de conductancia de transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), presente en el borde luminal de las células epiteliales. Su disfunción disminuye el flujo de agua hacia el espacio intraluminal e interfiere con la adecuada hidratación de las secreciones, con la subsecuente obstrucción de las vías aéreas y los ductos pancreáticos, entre otros^1,2.

El gen que codifica la proteína CFTR fue identificado mediante técnicas de clonación posicional en 1989³. Simultáneamente, se descubrió que la mayoría de los pacientes tenía una mutación caracterizada por la pérdida de los nucleótidos 1653 al 1655 del gen, resultando en la deleción del aminoácido fenilalanina en la posición 508 de la proteína CFTR⁴. Esta mutación, denominada DF508, provoca una alteración en el procesamiento postranscripcional de la proteína, con disminución del tráfico de la proteína madura desde el aparato de Golgi a la superficie celular apical². Hasta la fecha, se han descrito más de 900 mutaciones que alteran la función de la proteína y alrededor de 200 polimorfismos⁵.

El patrón y la frecuencia de las mutaciones dependen del origen étnico del paciente, y es así como se han descrito mutaciones propias de distintos grupos raciales. La población chilena es una mezcla compleja de ancestros amerindios y europeos, entre otros. Estudios sobre la presencia de 5 mutaciones comunes en 36 pacientes chilenos encontraron la mutación DF508 en 29% de los alelos estudiados y la mutación G553X en 4%, es decir, sólo se identificó un tercio de los alelos⁶. Otro estudio de 3 mutaciones en 11 pacientes encontró la DF508 en 22% y la G542X en 14% de los alelos⁷. Es relevante destacar que el tipo de mutaciones que tiene un paciente es uno de los elementos pronósticos, al menos desde el punto de vista de insuficiencia pancreática^1,2,8. Además, el análisis de mutaciones permite la identificación de portadores asintomáticos, información que es de suma relevancia para el consejo genético. Por otra parte, existe evidencia experimental de que los distintos tipos de mutaciones pudieran ser susceptibles a corrección por fármacos específicos, por lo cual el genotipo podría tener un rol sobre las decisiones terapéuticas⁹.

El objetivo de este trabajo multicéntrico fue expandir la caracterización del genotipo de pacientes chilenos con fibrosis quística.

MATERIAL Y MÉTODO

Diagnóstico. Se estudiaron pacientes con diagnóstico categórico o de sospecha de FQ basado en los antecedentes clínicos y resultados de la prueba de sudor por iontoforesis con sistema Gibson Cooke¹⁰ (3 centros) o conductancia por método Wescor Macroduct¹¹ (2 centros), en seguimiento en los Hospitales Clínico de la P Universidad Católica de Chile, Exequiel González Cortés, Luis Calvo Mackenna, San Borja-Arriarán y Clínico de Valdivia. La información clínica relevante se recolectó mediante un breve cuestionario o un resumen proporcionado por el médico tratante.

Laboratorio. Se obtuvo una muestra de sangre de cada paciente, de la cual se extrajo ADN genómico mediante el sistema Wizard (Promega). La identificación simultánea de 20 mutaciones y del alelo ∆F508 normal (Tabla 1) se realizó mediante reacción de polimerasa en cadena (PCR) alelo-específica múltiple con el ensayo comercial Elucigene CF20 (Astra Zeneca) basado en el método de Ferrie y cols¹². Las mutaciones buscadas en cada reacción se describen en la Tabla 1. Para cada paciente se realizaron 3 reacciones de amplificación paralelas, cada una compuesta por una mezcla de 6-8 pares de partidores para un número similar de mutaciones y deoxinucleótidos trifosfato. La mezcla de PCR contenía 5 µl de ADN (concentración de 2 a 20 ng/µl), 5 µl de una solución de AmpliTaq Gold diluida en el buffer provisto por el fabricante y 15µl de la mezcla de partidores en cada reacción. Cada una contenía, además, otros dos pares de partidores de control, que amplifican otras regiones del genoma. La reacción de amplificación se realizó en un termociclador MJ Research de acuerdo a las indicaciones del fabricante, es decir, 20 min iniciales a 94°C para la activación de la enzima, seguida de 35 ciclos consistentes en denaturación a 94°C por 30 s, hibridación a 58°C por 2 min, extensión a 72°C por 1 min; y un período final de extensión de 20 min a 72°C. Quince µl del producto de PCR fueron sometidos a electroforesis en un gel de agarosa-Nusieve 3:1 al 3% durante 60-90 min a 60 V. Los geles fueron expuestos a un transiluminador ultravioleta para visualización y fotografiados en película Polaroid. Los tamaños moleculares de los productos de amplificación fueron comparados con un estándar de tamaño molecular de 50bp y la asignación de las mutaciones se basó en la presencia de bandas de tamaños esperados.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Escuela de Medicina de la Pontificia Universidad Católica, y se obtuvo consentimiento informado de los padres o pacientes.

RESULTADOS

Se incluyeron 75 pacientes en este estudio, 28 mujeres y 49 hombres, cuya edad promedio al ingreso al estudio fue de 13,8 años, con un rango de 1 mes a 45 años. Había 8 pares de hermanos y una pareja padre-hijo, pero para el análisis de los datos sólo se contabilizó el caso índice de cada familia. En 3 pacientes no se obtuvo información clínica suficiente como para poder ser incluidos. Seis pacientes fueron re-clasificados como portadores de otras patologías por sus médicos tratantes durante el curso del estudio, por lo que también fueron excluidos.

En los 57 pacientes restantes, es decir, en 114 alelos, identificamos 8 de las 20 mutaciones buscadas. Las frecuencias relativas de cada mutación encontrada en este estudio, así como la frecuencia latinoamericana y mundial según los datos del Consorcio Internacional de Mutaciones de FQ^5,13 se resumen en la Tabla 2 y las fotografías de geles representativos se observan en la Figura 1.

Figura 1. Análisis de productos de PCR en 4 pacientes representativos. La primera columna contiene el estándar de tamaño molecular, con bandas crecientes cada 50pb. Los 3 carriles siguientes son los productos de las reacciones 1, 2 y 3 (ver Tabla 1) para cada paciente. Las flechas en el gel del paciente A señalan los productos de control interno. Los resultados son los siguientes: paciente A: desconocida/desconocida (la banda en el carril 2 corresponde a la variante normal de la DF508); paciente B: heterocigoto compuesto G542X/W1282X; paciente C: DF508/desconocida; y paciente D: homocigoto DF508/∆F508 (nótese la ausencia de la banda DF508 normal en el carril 2).

A continuación, los pacientes fueron clasificados en 4 categorías según su presentación clínica y resultado de la prueba de sudor. El grupo A estaba compuesto por pacientes con síntomas respiratorios y digestivos más prueba de sudor con cloro >60 mEq/l; el grupo B, con síntomas en un solo sistema y cloro > 60 mEq/l; y los grupos C y D, por pacientes con prueba de sudor < 60 y con síntomas en ambos o sólo un sistema, respectivamente. El número y porcentaje de mutaciones detectadas en cada grupo se describen en la Tabla 3. La edad de los pacientes al ingreso al estudio era comparable entre los grupos, lo que descarta que esta variable afectara la presencia de los síntomas. En el grupo A, que reúne a aquellos pacientes con la presentación clínica más típica y que constituye el grupo más numeroso, se encontró ambas mutaciones en 20 individuos, 1 mutación en 19 y ninguna en sólo 4. En el grupo B, se encontró una de las 2 mutaciones en 5 de los 6 pacientes. En el grupo C, los 2 alelos identificados pertenecían a una misma paciente, que tenía la mutación DF508 y la mutación intrónica 3849+10kb C>T, que se ha descrito en asociación con prueba de sudor menos elevado¹⁴. No encontramos mutaciones en los pacientes del grupo D. El Panel de Consenso de la Fundación de FQ sugiere que este diagnóstico debe basarse en la presencia de al menos una característica fenotípica típica y 2 pruebas de sudor con cloro > 60 mEq/L y/o la presencia de 2 mutaciones patogénicas^1,15. Basado en esto, los pacientes en nuestros grupos A y B, y la paciente del grupo C con ambas mutaciones detectadas cumplirían con los criterios de diagnóstico. En estos 50 pacientes, el panel identificó al 66% de los alelos mutados, con la mutación DF508 presente en el 45% del total. En 45 pacientes de estos sujetos, es decir, en 90%, detectamos al menos una de las 2 mutaciones, y en casi la mitad de ellos, se identificó el genotipo completo.

DISCUSIÓN

Este estudio incluye el mayor número de pacientes y de mutaciones evaluadas hasta la fecha en nuestro país. Tal como se ha descrito en la mayoría de las poblaciones estudiadas, la mutación DF508 fue la más frecuente y el resto de las mutaciones se encontraron con frecuencias individuales < 7%. Nuestro porcentaje de detección es intermedio entre el promedio de los datos mundiales y los datos latinoamericanos del Consorcio Internacional de Mutaciones^5,13, aunque que éstos últimos están probablemente subestimados porque el número de mutaciones buscados fue menor que en nuestro estudio. Los hallazgos descritos enfatizan la observación de que, para poblaciones mixtas, la proporción de mutaciones "comunes" identificadas es proporcional a la frecuencia relativa de la mutación DF508, ya que la proporción contribuida por otros alelos es, en general, baja. La mutación G542X es de origen español⁵ y eso explicaría su mayor contribución relativa en nuestro país y Latinoamérica, comparada con los datos globales. La diferencia entre nuestros resultados y los datos chilenos publicados^6,7 puede deberse a que los tamaños muestrales fueron pequeños. Llama la atención, sin embargo, que el mayor porcentaje detectado en nuestro estudio se debió fundamentalmente a que encontramos el doble de alelos con la mutación DF508 que los otros estudios chilenos, y sólo en menor proporción, al hallazgo de otras mutaciones no buscadas. Nuestros datos son similares a otros de poblaciones latinoamericanas, que han encontrado la mutación ∆F508 en cerca de la mitad de los alelos^13,16,17.

La metodología utilizada en este estudio permite diferenciar entre homocigotos DF508/DF508 y heterocigotos compuestos para la mutación ∆F508/desconocida, pero no permite hacer esta distinción para el resto de las mutaciones estudiadas. Sin embargo, la posibilidad de encontrar homocigotos para una mutación que tiene una frecuencia, por ejemplo, de 1% de portadores en una población no consanguínea sería de 1:40.000 según la ley de equilibrio de Hardy-Weinberg¹⁸. Esto hace difícil justificar la inclusión de reacciones adicionales para la evaluación inicial de todos los pacientes por su enorme costo adicional con muy bajo rendimiento. En los casos en que, por consanguinidad de los padres u otros motivos, sea necesario discriminar entre estos 2 genotipos, es posible hacer un análisis adicional para la mutación en cuestión o alternativamente, estudiar a ambos padres y deducir el genotipo del hijo.

Nuestro panel no detectó las mutaciones en el 42% de los alelos totales, ni en el 34% de los alelos de pacientes que cumplen con los criterios diagnósticos recomendados, sugiriendo que existe alguna otra mutación predominante, tal vez propia de nuestra población, o, con mayor probabilidad, varias otras mutaciones de frecuencias individuales bajas. El análisis molecular mediante metodologías como la secuenciación podrían ayudar a discriminar entre estas posibilidades. La relativa baja sensibilidad actual del panel de 20 mutaciones es un aspecto importante para el clínico, ya que implica que este análisis no puede ser utilizado para descartar el diagnóstico de FQ.

Pese que este trabajo no tuvo como objetivo el establecer correlaciones entre el fenotipo y el genotipo, llama la atención el predominio de mutaciones no detectadas entre los pacientes con presentaciones menos sintomáticas y atípicas. Es posible que esto se deba a que las mutaciones no detectadas se asocien mayoritariamente a estos cuadros más leves.

Una de las descritas es la variante poli-T en el intrón 8 del gen, que se asocia a presentaciones clínicas atípicas u oligosintomáticas y cuya presencia aún no ha sido determinada en nuestra población¹⁹. Otra explicación alternativa es que algunos de estos pacientes tengan otras patologías. Según Welsh y cols¹, hasta 40% de los pacientes derivados a centros de FQ han recibido diagnósticos erróneos debido a resultados tanto falsos positivos como falsos negativos en la prueba de sudor. Sin duda, existen casos en que es difícil comprobar o descartar en forma definitiva la sospecha de FQ, y hay pacientes con esta enfermedad con Cl- en sudor bajo 60 mEq/l. Por otro lado, se ha recomendado el uso de un nivel de 70 mEq/l de cloro en sudor para el diagnóstico en adultos, por su mayor especificidad²⁰. Un análisis más detallado de la presentación clínica, la búsqueda de otras manifestaciones como azoospermia en hombres y exámenes adicionales como la diferencia de potencial nasal²¹ podrían ser útiles para aclarar el diagnóstico de estos pacientes y definir la real sensibilidad del panel para nuestra población.

Consideramos que es necesario aumentar la capacidad de detección y lograr la identificación de otras mutaciones que puedan ser prevalentes en nuestro país. Esto podría facilitar estudios poblacionales para determinar la real frecuencia de enfermos y portadores, permitir un diagnóstico precoz, y utilizarse como un elemento dentro de programas de tamizaje neonatal, cuyos beneficios en los aspectos nutricionales están siendo demostrados²³. La posibilidad actual de detectar alrededor de dos tercios de las mutaciones por un método sencillo nos permite sugerir que el análisis molecular sea incluido en la evaluación clínica de los pacientes chilenos con FQ, tanto como elemento diagnóstico y pronóstico, por su utilidad para el consejo genético, y con los avances de la farmacogenética, para el tratamiento de los pacientes en el futuro.

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