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Journal of Chinese Integrative Medicine Free Full Text
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Technique and Methods
Journal of Chinese Integrative Medicine: Volume 2   January, 2004   Number 1

DOI: 10.3736/jcim20040121
Genetic identification of internal transcribed spacers sequence in rDNA of Artemisis iwayomogi Kitam. and other two Artemisia species
1. KIM Sung-Yong (Department of Identification of Chinese Drugs,Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing,Jiangsu Province 210029,China E-mail: jcy115@hanmail.net)
2. CHEN Jian-Wei (Department of Identification of Chinese Drugs,Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing,Jiangsu Province 210029,China E-mail: chenjw55@sina.com)
3. LIU Zhong-Quan (Research Institute of Genetic Resource,Nanjing Normal University, Nanjing,Jiangsu Province 210097,China )
4. WANG Yong-Zhen (Department of Identification of Chinese Drugs,Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing,Jiangsu Province 210029,China )

Objective: To make an useful identification method for the molecule of DNA on 3 herbs of Artemisia genus and compare the differences of the genes of Korean and Chinese species of Artemisia.

Methods: Sequence of 3 herbs (Artemisia sacrorum Ledeb., Artemisia iwayomogi Kitam. and Artemisia capillaris Thunb.) was determined by PCR sequence system. DNA was extracted from rDNA/ITS (internal transcribed spacers) and 5.8 s. The analysis was based on the amplification through DNA sequence system.

Results: There were profound differences between the Korean Artemisia and Artemisia sacrorum L.. These 2 herbs had a difference in the PCR amplifications of the agarose gel electrophoresis. There was a slight difference in the analysis of the DNA sequence system, and the substitution percentage for ITS gene fragments sequence was 3.96%.

Conclusion: Analytic identification method on sequence system of ITS in rDNA is effective for these 3 herbs.

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J Chin Integr Med, 2004, 2(1): 58-61

作者简介: 金成庸(1973-),男,韩国籍,在读博士研究生,现工作于韩国成均馆大学校药学院药剂学研究室.E-mail:jcy115@hanmail.net

Correspondence to: Prof. CHEN Jian-Wei. E-mail: chenjw55@sina.com  

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     中药茵陈为菊科植物茵陈蒿(Artemisia capillalis Thunb.)的干燥地上部分[1],其主要功效为利胆退黄,是治疗黄疸的要药[2]。同属植物韩茵陈(Artemisia iwayomogi Kitam.)在韩国作为茵陈蒿的代用品[3],用于治疗黄疸,在《东医宝鉴》里的韩国名称是“De yu za gi”[4],在日本《生药学概论》[5]、《原色日本植物图鉴》[6]和韩国《生药学》[7]里均有记载。在日本《生药学概论》[5]里记载的韩茵陈(Artemisia iwayomogi Kitam.)与《中国高等植物图鉴》[8]中的白莲蒿(Artemisia gmelinii)拉丁名相同。在《中国植物志》里白莲蒿(Artemisia gmelinii)的学名通过各国标本对照应为Artemisia sacrorum Ledeb.,而Artemisia gmelinii是误定[9]。按照《中国高等植物图鉴》上韩茵陈(A. iwayomogi Kitam.)的记载,应与《中国植物志》上记载的白莲蒿(A. sacrorum L.)的拉丁学名存在等同关系。
     但是,通过形态学及组织细胞学的研究,韩茵陈和白莲蒿存在差异,为了进一步研究韩茵陈和白莲蒿是否为同一植物,同时对来源于两个不同国家的茵陈进行遗传差异的探讨。本文对韩茵陈、白莲蒿和茵陈蒿的rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacers, ITS)序列进行测序及分析。

 
   

1   材料和方法
1.1   实验仪器与材料

1.1.1   试剂   1×CTAB提取缓冲液:50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0);0.7 mol/L NaCl;10 mmol/L EDTA;0.14% 2-巯基乙醇(V/V)。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为中国医药上海化学试剂公司产品;琼脂糖为上海药物研究所产品;Taq酶为Promega公司产品;柱式聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)产物纯化试剂盒为上海生物工程有限公司的产品,氯仿、异戊醇等其它试剂均为国产分析纯。
1.1.2  仪器  ABI PRISM 310型自动测序仪为PE公司产品;PTC-200型PCR为Gene公司产品;UVP(white/ultraviolet transilluminator)为ULTRA-VIOLET公司的产品;DYY-Ⅲ 8A稳压稳流定时电泳仪为北京第六仪器厂产品;TGLL-18G台式高速冷冻离心机为太仓市医疗器械厂产品。
1.1.3   实验材料   中药材茵陈蒿和白莲蒿为来自同一产地(江苏省南京市)的新鲜叶子。茵陈蒿和白莲蒿经本校中药鉴定学教研室王永珍教授鉴定。韩茵陈为干燥叶子,由韩国顺天大学校韩药资源系Youn Kyung Won 助教授鉴定,购自韩国忠北药材市场,并冷冻保存1年以上。
1.2   实验方法
1.2.1   DNA的提取和检测
   实验前试剂及设备进行严格的灭菌处理。取样品0.2 g,表面经双蒸水清洗(反复几次),去除表面污物和虫子,防止外源DNA污染,用液氮冰冻后,再充分研磨,然后转入1.5 ml的离心管中加1×CTAB缓冲液0.5 ml,置65℃的水浴锅30 min,每5 min轻轻上下颠匀,用等体积氯仿异戊醇(体积比24∶1)抽提,12 000 r/min离心30 s,取上清液加2倍或2.5倍体积无水乙醇,混匀,12 000 r/min,离心30s,去上清液,用适量70%乙醇荡洗2次,室温晾干。加超纯水或TE 80 ml溶解DNA,然后用DNA纯化试剂盒进行纯化,以去除有色物质和一些次生抑制物。取DNA提取液5 ml经1%琼脂糖凝胶上电泳,EB染色,UVP扫描检测。
1.2.2  PCR扩增  引物序列为P15′-GTAACAAGGTTTCCGTA-3′,P25′-TTATTGATATGCCTAAACTCGGG-3′(Takara公司合成),扩增rDNA ITS和5.8 s区段约700 bp[10],见图1。PCR反应的体积为30 ml,内含模板DNA约10~100 ng,10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3),50 mmol/L KCl, 2.5 mmol/L MgCl2,4种dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各150 mmol/L,0.01%明胶,l U Tag DNA聚合酶,每1种引物0.3 mmo1/L,最后加入适量无菌水。PCR反应在PTC-200型基因扩增仪上进行,反应先经95℃预变性4 min,然后95℃ 40 s变性,55℃ 40 s复性,72℃ 1.5 min延伸,完成30个循环后,72℃ 5 min补齐。

图1 植物组织核糖体内转录间隔区
Fig 1 Organization of plant nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer(ITS) region

1.2.3   PCR扩增产物检测   取PCR产物5 ml在1%琼脂糖凝胶上用1×TBE冲泳缓冲液电泳,EB染色,UVP扫描检测。
1.2.4   PCR产物的纯化及测序   PCR产物用柱式PCR产物纯化试剂盒纯化,按试剂盒操作指南进行。样品在ABI PRISM 310型自动测序仪上进行自动测序。
1.2.5   数据分析   所得DNA序列输入计算机,经对位排列后,用分子系统发育分析软件MEGA统计各样品DNA序列间的差异百分率和转换/颠换数。

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2   结 果
2.1   韩茵陈、茵陈蒿和白莲蒿样品DNA提取液的电泳检测
   3种样品的DNA提取液经电泳检测均能检测到DNA,见图 2。


图2   3种茵陈样品DNA提取液的电泳检测
Fig 2 Agarose gel electrophoresis of DNA extractedfrom 3 species of Artemisia

Yin: Artemisia sacrorum Ledeb.; Bai: Artemisia iwayomogi Kitam.; Han: Artemisia capillaris Thunb.; P: extract control; M:    DNA size marker: EcoRⅠ, Hind Ⅲ digested λDNA

2.2   PCR反应产物扩增   PCR反应产物经电泳rDNA ITS 基因片段扩增,所有样品均得到阳性扩增带,分子量约为700 bp,扩增对照均为阴性,其中茵陈蒿和白莲蒿为单一的条带,而韩茵陈具有2条扩增带。见图3。


图3 3种茵陈样品DNA片断 PCR扩增产物的电泳检测
Fig 3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplifications of gene fragment from DNA extracted from 3 species of Artemisia
Yin: Artemisia sacrorum Ledeb.; Bai: Artemisia iwayomogi Kitam.; Han: Artemisia capillaris Thunb.; P: amplify control; M:DNA size marker: EcoRⅠ, Hind Ⅲ digested λDNA

2.3   DNA序列分析   以3个样品中提得的DNA模板约700 bp基因片段测序结果经对位排列后得到630 bp的DNA序列(见图 4),共有52个碱基变异位点,轻链中A、T、C和G的含量分别为22.0%~23.1%、23.5%~24.9%、25.8%~27.2%、26.3%~27.3%,平均为22.7%、24.3%、26.3%和26.7%。3种样品的碱基替代率(差异百分率)为3.96%~6.98%,平均为5.55%(见表1)。茵陈蒿和韩茵陈样品间的碱基替代率为5.71%,韩茵陈和白莲蒿样品间的碱基替代率为6.98%;3个样品间的碱基颠换率为1.59%~2.70%,茵陈蒿和韩茵陈样品间的碱基颠换率为1.59%,韩茵陈和白莲蒿间的碱基颠换率为1.75%,白莲蒿和茵陈蒿样品间的碱基颠换率为2.70%。

表1   3种茵陈样品基因片断的碱基替代率和颠换率
Tab 1 Numbers of transitions/transversions (above diagonal) and substitution percentage (below diagonal) for ITS gene frag- ment sequences of 3 species of Artemisia

Code

Bai

Han

Yin

Bai

-

14/11

27/17

Han

3.96

-

26/10

Yin

6.98

5.71

-

Yin: Artemisia sacrorum Ledeb.; Bai: Artemisia iwayomogi Kitam.; Han: Artemisia capillaris Thunb.


图4   3种茵陈样品基因片断的DNA序列
Fig 4  Sequence database of rDNA ITS gene fragment from 3 species of Artemisia

Yin: Artemisia sacrorum Ledeb.; Bai: Artemisia iwayomogi Ki-tam.; Han: Artemisia capillaris Thunb.. Dots indicate identity

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     DNA提取中,茵陈蒿和白莲蒿均采用新鲜叶片,韩茵陈因为无法得到新鲜药材,采用干燥样品提取,使用本实验的提取方法(CTAB法)[11,12],3种药材均得到所需的DNA样品,经干燥保存的韩茵陈样品,提取的DNA与新鲜样品没有显著差别。
     PCR反应产物经电泳检测,在rDNA ITS基因片段的扩增中,所有的样品均得到阳性扩增带,分子量约为700 bp,扩增对照均为阴性。其中,对茵陈蒿和白莲蒿的电泳检测得到阳性扩增带1条,在对韩茵陈的检测中得到阳性扩增带2条,说明白莲蒿和韩茵陈存在明显差异,而韩茵陈和白莲蒿样品间的碱基替代率为3.96%,此方法亦可用作为两者的品种鉴定。韩茵陈的序列与白莲蒿均在同样大小片段的条带上测得。
     在韩国医学著作中,韩茵陈习惯作为茵陈蒿(Artemisia capillalis Thunb.)的代用品,而且一直延用至今,为了寻找韩茵陈替代茵陈蒿药用的证据,本文就两者在遗传学上的关联程度进行了药材分子标记鉴定,通过对其 rDNA ITS1,5.8 s;ITS2基因片段的DNA序列分析,发现茵陈蒿和韩茵陈样品间的碱基替代率为5.71%。说明它们之间既有差异又有相近的亲缘关系。
     综上所述,韩茵陈与白莲蒿存在遗传学上的明显差异,不应看作同一种植物,建议《中国高等植物图鉴》将其分列为两种植物。

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References
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3. 全国韩医科大学本草学教授共同编著. 本草学[M]. 第1版. 汉城: 永林社, 1994. 328-329.
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5. 难波恒雄, 津田喜典. 生药学概论[M]. 第1版. 东京: 南江堂, 1990. 216.
6. 北村四郎, 村田, 堀腾. 原色日本植物图鉴(草木编Ⅰ)[M]. 第1版. 东京: 保育社, 1983. 542-543.
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11. Kohjyouma M, Nakjima S, Namera A, et al. Random amplified polymorphic DNA analysis and variation of essential oil components of Atractylodes plants[J]. Biol Pharm Bull, 1997, 20(5) : 502-506.
  
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